瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)檢測羊口瘡病毒

鮮思美，吳 健，楊 鈺，劉宗勝，劉 嬡，蘇 剛

（1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.貴州省動(dòng)物疫病研究所，貴州 貴陽 550025；3.畢節(jié)市七星關(guān)區(qū)農(nóng)牧局草地中心，貴州 畢節(jié) 551700；4.畢節(jié)市動(dòng)物產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)所，貴州 畢節(jié) 551700）

羊口瘡（Orf）亦稱羊傳染性膿皰皮炎、羊傳染性膿皰口炎、羊傳染性膿皰，是危害山羊和綿羊的一種高度接觸性傳染病，其發(fā)病率為2.2%～17.7%，病死率為0～51.4%，羊口瘡在養(yǎng)羊的國家和地區(qū)普遍發(fā)生，常呈群發(fā)性流行，是嚴(yán)重威脅養(yǎng)羊業(yè)，具有重要經(jīng)濟(jì)意義的病毒病。同時(shí)該病是一種急性、高度接觸性人獸共患傳染病，對人類健康構(gòu)成威脅［1］。由于OrfV與其他許多病原(如口蹄疫病毒、羊痘病毒)感染動(dòng)物后的臨床癥狀非常相似，臨床上極其容易造成誤診。目前，診斷Orf的方法有電子顯微鏡檢查、病毒分離、動(dòng)物接種試驗(yàn)、血清學(xué)方法、PCR擴(kuò)增和LAMP技術(shù)等［2］，但相對于基層養(yǎng)殖場（戶）有必要尋找一種簡便、適用的血清學(xué)診斷方法。本試驗(yàn)將羊口瘡痂皮毒回歸兔體，制備高免血清，進(jìn)行瓊脂擴(kuò)散（AGP）試驗(yàn)，效果較好。報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 選擇體重2 500 g以上，健康無病家兔，飼喂觀察7 d后供制備高免血清用。

1.2 受檢材料 Orf-HZ病料采自貴州省赫章縣；Orf-DF病料采自貴州省大方縣；Orf-ZY病料采自貴州省鎮(zhèn)遠(yuǎn)縣；Orf-CQ病料采自重慶病料；Orf-CS病料，采自貴州省長順縣。羊口瘡細(xì)胞毒、健康山羊血清、兔血清和羊正常皮膚組織由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 對照毒株 山羊痘疫苗，批準(zhǔn)文號：新生藥字（2001）284403；口蹄疫病毒O型、亞洲I型二價(jià)滅活疫苗，批準(zhǔn)文號：獸藥生字（2007）310017047。

1.4 兔抗羊口瘡病毒高免血清的制備［4］

1.4.1 羊口瘡痂皮毒抗原的制備 稱Orf痂塊毒1 g，加含10 000 IU/mL雙抗30 mL，充分研磨，超聲波乳化破碎3次后，4℃靜置過夜。以5 000 r/min離心15 min，取上清液，加含0.9%NaCl的PEG6000沉淀病毒，4℃過夜后，以10 000 r/min離心20 min，棄上清液，沉淀用適量生理鹽水溶解，裝入透析袋中0.9%NaCl透析24 h，包埋于PEG6000濃縮至10 mL，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 兔抗羊口瘡病毒高免血清的制備 取羊口瘡痂皮毒抗原1 mL，加入弗氏完全佐劑1 mL，混合均勻，制成包被抗原，于家兔的兩股內(nèi)側(cè)和脊椎兩側(cè)皮內(nèi)各注射10個(gè)點(diǎn)，第7天重復(fù)注射1次；第14天耳靜脈注射羊口瘡痂皮毒抗原0.5 mL，第21天再耳靜脈注射0.5 mL，同時(shí)在脊柱兩側(cè)皮內(nèi)分兩點(diǎn)注射羊口瘡痂皮毒抗原各0.1 mL；第28天心臟采血，分離血清[7]，于滅菌瓶內(nèi)-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)（AGP）

1.5.1 瓊脂板的制備 采用PEG平板，在普通平板的基礎(chǔ)上加聚乙二醇，操作術(shù)式按7孔型打孔。

1.5.2 瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn) 在瓊脂板的中央孔加兔抗OrfV高免血清（已采用正常羊皮膚抗原吸收處理），周邊孔加被檢抗原，加樣完畢后，將平板放入濕盒內(nèi)，放入37℃恒溫箱，20 h左右開始觀察，在陽性血清孔與被檢抗原孔之間出現(xiàn)明顯沉淀反應(yīng)者即判為陽性。

1.5.3 兔抗羊口瘡高免血清最佳作用濃度的方陣分析［5］將所制得的兔抗OrfV高免血清加入中央孔，瓊脂擴(kuò)散陽性抗原加入周邊孔，抗體、抗原分別作原液，1∶2，1∶4，1∶8，1∶16，1∶32，1∶64，1∶128，1∶256倍比稀釋，抗體的每一個(gè)稀釋度分別與抗原的各稀釋度進(jìn)行瓊擴(kuò)試驗(yàn)方陣分析，從而確定瓊脂擴(kuò)散抗體的最佳濃度。

1.6 特異性試驗(yàn)及其阻斷試驗(yàn)

1.6.1 特異性試驗(yàn) 取最適稀釋度的瓊脂擴(kuò)散診斷抗體與山羊痘疫苗毒、口蹄疫疫苗毒作交叉試驗(yàn)。

1.6.2 特異性阻斷試驗(yàn)［6］為了進(jìn)一步驗(yàn)證瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)檢測Orf病毒的特異性，筆者用兔抗Orf血清50 μL分別與50、100、150、200 Orf病毒和250 Orf病毒混合，37℃作用1 h。再與50 μL Orf病毒抗原進(jìn)行瓊擴(kuò)試驗(yàn)觀察結(jié)果。

1.7 臨床疑似羊口瘡病料的抗原檢測 5份臨床疑似羊口瘡病羊的痂皮分別制成1∶1～1∶2的乳劑，經(jīng)3次反復(fù)凍融后，離心，取上清液，作為待檢抗原分別與瓊脂擴(kuò)散診斷抗體進(jìn)行試驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 羊口瘡痂皮毒抗原與兔抗羊口瘡高免血清的AGP方陣分析 結(jié)果見（表1）。

表1 羊口瘡痂皮毒抗原AGP方陣分析結(jié)果

由表1可以看出，羊口瘡痂皮毒抗原從兔體制備的高免血清經(jīng)瓊擴(kuò)試驗(yàn)檢測血清價(jià)為1∶16。與最高稀釋度抗原形成沉淀線的抗體的最高稀釋度為1∶4，實(shí)際檢測時(shí)以1∶4倍稀釋作為診斷抗體。

2.2 特異性試驗(yàn)結(jié)果 取最適稀釋度診斷抗體與山羊痘疫苗毒、口蹄疫疫苗毒進(jìn)行AGP，結(jié)果這2種陽性抗原與診斷抗體之間沒有出現(xiàn)沉淀線（圖1）；特異性阻斷試驗(yàn)兔抗Orf血清50 μL與100、150、200 Orf病毒和250 Orf病毒抗原混合作用后，再與50 μL Orf病毒抗原進(jìn)行瓊擴(kuò)試驗(yàn)，未見沉淀線（圖2）。

由圖1可知，1∶4倍稀釋的羊口瘡診斷抗體與羊口瘡痂皮毒和細(xì)胞毒之間出現(xiàn)明顯的白色沉淀線，而與羊口瘡陰性血清、生理鹽水、山羊痘疫苗毒和口蹄疫疫苗毒之間未見沉淀線；由圖2可知，50 μL羊口瘡陽性血清能被100、150、200痂皮毒和250的痂皮毒特異性阻斷，表明應(yīng)用兔抗羊口瘡高免血清來檢測羊口瘡病毒抗原的反應(yīng)是特異的。

2.3 臨床疑似羊口瘡病料的抗原檢測結(jié)果 對5例不同地區(qū)臨床疑似羊口瘡痂皮毒抗原的檢查結(jié)果：CS病料、ZY病料和DF病料均是在2 h出現(xiàn)明顯的沉淀線，CQ病料、HZ病料在20 h后出現(xiàn)沉淀線（圖3）。

3 小結(jié)和討論

3.1 本試驗(yàn)中用痂皮毒抗原從兔體制備的高免血清效價(jià)為1∶16；抗體1∶16倍稀釋，可檢測到1∶4倍稀釋的痂皮毒抗原，而抗體作1∶4倍稀釋，則可檢測到1∶128倍稀釋的痂皮毒抗原，為了避免漏檢，我們認(rèn)為高免血清1:4倍稀釋是診斷用抗體的最佳濃度。

3.2 羊口瘡痂皮毒抗原制備兔抗Orf高免血清瓊擴(kuò)效價(jià)與王廷璞等［4］報(bào)道一致，均為1∶16，這與Orf V具有高度的嗜上皮性，主要引起局部強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，且以細(xì)胞免疫為主，體液免疫水平較低有關(guān)。通過方陣分析后，診斷抗體濃度為1∶4應(yīng)用于5份臨床疑似病料的檢測取得了很好的效果，而健康山羊血清和兔血清不和待檢抗原產(chǎn)生沉淀線。

3.3 痂皮毒抗原免疫家兔制備的高免血清在未經(jīng)處理的情況下，能與相應(yīng)的痂皮毒抗原產(chǎn)生沉淀線，同時(shí)也可以和羊正常皮膚抗原產(chǎn)生沉淀線；采用羊正常皮膚抗原吸收處理后的兔抗羊口瘡高免血清再進(jìn)行瓊擴(kuò)反應(yīng)，與痂皮毒抗原產(chǎn)生沉淀線，而與正常皮膚抗原不產(chǎn)生沉淀線，說明該診斷抗體經(jīng)羊正常皮膚抗原吸收處理后可以用來診斷本病。

3.4 山羊痘病毒、口蹄疫病毒和羊口瘡病毒感染羊在臨床癥狀和病理變化相似，難以及時(shí)鑒別診斷。山羊痘抗血清能中和羊口瘡病毒，但羊口瘡血清不能中和山羊痘病毒，羊口瘡高免血清作為診斷抗體通過特異性試驗(yàn)及其特異性阻斷試驗(yàn)，結(jié)果表明，應(yīng)用兔抗羊口瘡高免血清來檢測羊口瘡病毒抗原的反應(yīng)是特異的，不與GPV、FMDV抗原發(fā)生交叉反應(yīng)，這一診斷方法可將GPV與OrfV引起羊的皮膚癥狀為主的疫病區(qū)別開來。所以，建立該方法具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

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[2]劉永杰，張克山，孔漢金，等.羊傳染性膿皰診斷技術(shù)研究進(jìn)展[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2013，34（2）：96-99.

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[4]鮮思美.應(yīng)用瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)檢測新城疫抗原[J].貴州畜牧獸醫(yī)，2002，26（2）：5-6.

[5]程安春.瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)檢測雛鵝新型病毒性腸炎病毒及抗體的研究[J].中國獸醫(yī)雜志，1999，25（3）：3-6.