益生菌對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠IL-1β、CD44的作用

王 雪，顏 玉，任秀英，鮑秀琦，姜 威

（佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003）

潰瘍性結(jié)腸炎（Ulcerative colitis，UC）是一種病因不明的慢性非特異性炎性疾病，主要累及直腸和結(jié)腸，從末端結(jié)腸開始，逆行性向近段發(fā)展，呈連續(xù)性分布，甚至累及全結(jié)腸和末端回腸，潰瘍性結(jié)腸炎的特點(diǎn)在于潰瘍的形成，主要病變集中在大腸黏膜及黏膜下層，UC 的患者主要臨床表現(xiàn)輕重不等，多表現(xiàn)為腹瀉，黏液膿血便，腹痛，里急后重，反復(fù)發(fā)作，長期遷延不愈的慢性過程。潰瘍性結(jié)腸炎在西方國家發(fā)病率較高，亞洲較少，隨著人們生活水平的提高，該病的患病率在我國有上升趨勢［1］。令人遺憾的是，UC 的病因及發(fā)病機(jī)制還未明確，且缺乏特效的治療方法，本實(shí)驗通過檢測UC大鼠血清IL-1β、CD44的變化，來探討益生菌治療UC 的機(jī)制，為益生菌在臨床上的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗藥物

惠迪（美沙拉嗪腸溶片）：廠家：佳木斯鹿靈制藥有限公司，批號：國藥準(zhǔn)字H19980148，主要成分：美沙拉嗪，規(guī)格：0.25g／片；美腸安（枯草桿菌二聯(lián)活菌腸溶膠囊）：廠家：北京韓美藥品有限公司，批號：國藥準(zhǔn)字S20030087，成分：枯草桿菌及糞腸球菌二聯(lián)活菌制劑，規(guī)格：250mg／粒；36%乙酸；石蠟油；乙醚。

1.2 藥物劑量

1片美沙拉嗪腸溶片研磨溶于6mL蒸餾水制成混懸液；1粒美腸安膠囊去殼后溶于16mL 蒸餾水；將36%乙酸用生理鹽水稀釋為5%乙酸溶液。

1.3 試劑

IL-1β試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）；CD44試劑盒（上海晨易生物科技有限公司）。

1.4 動物模型的建立及給藥方法

健康Wistar大鼠32只，雌雄各半，體質(zhì)量（200±20）g，清潔級，由大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗動物中心提供，隨機(jī)分成4組，每組8只，正常組（G1）、模型組（G2）、美沙拉嗪組（G3）、美腸安聯(lián)合美沙拉嗪組（G4）。正常組常規(guī)飼養(yǎng)，不造模，其余各組大鼠禁食不禁水24h，乙醚麻醉后，用直徑2mm 的橡膠導(dǎo)管插入距肛門約8cm 處的腸腔內(nèi)，將5%乙酸溶液按0.25mL／100g緩慢推入，將大鼠倒置20秒后用生理鹽水沖洗兩次，之后常規(guī)飼養(yǎng)，制備UC 大鼠模型，24h后給藥，G1、G2組：每只每天生理鹽水2mL 灌胃；G3組：每只每天美沙拉嗪溶液2mL灌胃；G4組：每只每天美腸安溶液2mL灌胃（上午9時），美沙拉嗪溶液2mL灌胃（下午5時），每天各組大鼠用藥時間相同。連續(xù)用藥7d，7d后處死各組大鼠。

1.5 標(biāo)本的采集

乙醚麻醉下經(jīng)腹主動脈采血4mL，4℃冰箱中靜置，打開腹腔，分離出全結(jié)腸，選擇結(jié)腸病變最嚴(yán)重的部位剪取1cm×1cm，放入10%甲醛固定，用80%，90%，95%，100%乙醇進(jìn)行梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，進(jìn)行石蠟切片。

1.6 大鼠血清IL-1β及CD44的測定

3h后冰箱中取出血漿，3000rpm 離心15min，留取血清，通過ELISA 法測定大鼠血清IL-1β及CD44的表達(dá)，采集數(shù)據(jù)。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大體觀察

G1組：結(jié)腸黏膜表面光滑，未見黏膜充血、糜爛及潰瘍，腸管未增厚。G2組：結(jié)腸黏膜粗糙不光滑，明顯充血、水腫，表面有膿性分泌物，可見糜爛、潰瘍、出血，腸壁增厚。G3組：結(jié)腸黏膜不光滑，呈顆粒狀，充血水腫程度減輕，潰瘍表面愈合明顯，可見點(diǎn)狀出血。G4組：結(jié)腸黏膜表面光滑，輕度充血水腫，未見明顯潰瘍，腸壁增厚減輕。

2.2 顯微鏡下觀察

G1組：結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)清晰完整，黏膜下血管紋理清晰，腺體結(jié)構(gòu)排列規(guī)則，上皮細(xì)胞排列整齊，未見充血水腫、糜爛潰瘍。G2組：黏膜上皮大量壞死脫落，形成潰瘍及不同程度灶性糜爛，固有層大量炎性細(xì)胞浸潤，腺體破壞，可見隱窩膿腫。G3組：黏膜上皮缺損相對減輕，黏膜充血水腫減輕，可見淺潰瘍及灶性糜爛，糜爛較小較淺，部分已經(jīng)愈合，炎性細(xì)胞浸潤程度減輕，腺體增生。G4組：黏膜上皮缺損明顯減輕，基本正常，有少量炎性細(xì)胞浸潤，可見輕微充血水腫，肉芽組織增生。

2.3 大鼠血清IL-1β、CD44的含量測定

見表1。

表1 大鼠血清IL-1β和CD44的測定結(jié)果（pg／mL，±s）

表1 大鼠血清IL-1β和CD44的測定結(jié)果（pg／mL，±s）

注：與正常組（G1）比較，＊P＜0.05；與模型組（G2）比較，＃ P＜0.05；與美沙拉嗪組（G3）比較，＆P＜0.05；模型組大鼠在治療過程中死亡一只。

表中4組資料的IL-1β含量差異具有顯著性（P＜0.05）：G2組高于G1組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；G4組與G3組均低于G2組，差異有統(tǒng) 計學(xué)意義（P＜0.05），其中G4組IL-1β的表達(dá)較G3組IL-1β的表達(dá)降低更明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。表中4組資料的CD44含量差異具有顯著性（P＜0.05）：G2組高于G1組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；G4組與G3組均低于G2組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），其中G4組CD44的表達(dá)較G3組CD44的表達(dá)降低更明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

IL-1由主要巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，B 細(xì)胞、NK 細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞或成纖維細(xì)胞等有核細(xì)胞也可產(chǎn)生IL-1。IL-1調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，促進(jìn)炎癥細(xì)胞釋放而發(fā)揮作用。IL-1家族分三類，包括IL-1α、IL-1β和IL-1受體拮抗劑（IL-1Ra），其中IL-1β是很強(qiáng)的促炎細(xì)胞因子，在IL-1家族起重要作用。IL-1β基因位于染色體2q13-14，與IL-1α和IL-1Ra基因共同分布于430kb的區(qū)域內(nèi)并緊密連鎖［2］。近年來，IL-1基因的多態(tài)性與UC的關(guān)系備受國內(nèi)外學(xué)者重視［3］，目前，對IL-1β基因多態(tài)性的研究主要集中在31，511，3953等位點(diǎn)，研究結(jié)果不一，可能與研究對象種族差異有關(guān)。最新研究表明，IL-1β基因+3962C／T 位點(diǎn)存在單核苷酸多態(tài)性，其單核苷酸多態(tài)性基因結(jié)構(gòu)的變化可能與其調(diào)節(jié)功能密切相關(guān)。IL-1β包含153個氨基酸，在UC 中與抗原協(xié)同對腸粘膜局部發(fā)揮作用，使T 細(xì)胞活化，促進(jìn)單核-巨噬細(xì)胞等抗原提呈細(xì)胞的抗原表達(dá)，引起釋放炎癥介質(zhì)。IL-1β和IL-1受體的失衡是UC發(fā)生的重要環(huán)節(jié)［4］，研究表明，腸上皮細(xì)胞（IECs）參加腸的免疫系統(tǒng)，其能分泌IL-1Ra但不分泌IL-1β，而炎癥細(xì)胞由固有膜單核細(xì)胞（LPMC）分泌，所以ICEs分泌的IL-1Ra不能完全抵抗LPMC 分泌的IL-1β等炎癥細(xì)胞因子［5］。研究發(fā)現(xiàn)，隱窩炎癥表示UC 正處于活動期，發(fā)生隱窩炎癥時，IL-1β的含量與免疫球蛋白、白蛋白及α-抗胰蛋白酶等標(biāo)記蛋白丟失的量呈正相關(guān)［6］，故IL-1β的含量對判斷UC的病情有重要意義。

細(xì)胞黏附因子是位于細(xì)胞膜表面的糖蛋白分子，研究發(fā)現(xiàn)它與UC有密切關(guān)系，在炎癥免疫過程中受到人們重視。UC的腸道炎癥主要是白細(xì)胞浸潤到腸壁，而黏附因子在炎癥細(xì)胞的浸潤中起著重要作用。CD44廣泛表達(dá)于多種細(xì)胞表面的糖蛋白，又稱為黏附因子吞噬細(xì)胞膜糖蛋白，分子量為85KD-250KD的單鏈糖蛋白，作用是介導(dǎo)細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)之間和細(xì)胞之間黏附?；蜣D(zhuǎn)錄過程中mRNA 的選擇性剪接形成標(biāo)準(zhǔn)型（CD44S）、變異型（CD44V1-10），稱之為CD44家族?？膳c多種配體結(jié)合，有廣泛的生物學(xué)活性。CD44介導(dǎo)淋巴細(xì)胞與毛細(xì)血管網(wǎng)小靜脈中的內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合，引導(dǎo)淋巴細(xì)胞穿透血管壁，通過激活淋巴細(xì)胞，參與淋巴細(xì)胞歸位到淋巴組織，引起T 淋巴細(xì)胞活化，參與炎癥反應(yīng)。黏附因子CD44可以反映潰瘍性結(jié)腸炎的嚴(yán)重程度，對UC病情的判斷及藥物療效的觀察都有重要作用。美常安，即枯草桿菌和糞腸球菌復(fù)合制劑，屬于人體的有益菌，枯草桿菌是耐酸菌屬，而糞腸球菌是耐膽鹽菌，兩者結(jié)合明顯提高了在胃腸道的存活率，從而協(xié)同發(fā)揮最大的生物學(xué)作用。本實(shí)驗通過美腸安聯(lián)合美沙拉嗪治療大鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型顯示，美腸安和美沙拉嗪聯(lián)合治療組較美沙拉嗪治療組光鏡下改變趨于正常（P＜0.05）；IL-1β及CD44的表達(dá)均低于模型組（P＜0.05），而且效果明顯優(yōu)于美沙拉嗪單獨(dú)用藥（P＜0.05）。美腸安和美沙拉嗪聯(lián)合用藥治療結(jié)果表明，美腸安可能是通過補(bǔ)充UC時腸道減少的有益菌群，增加黏液分泌，抑制腸上皮細(xì)胞的凋亡，調(diào)節(jié)腸道免疫功能，增強(qiáng)腸道黏膜屏障，阻止病原菌的侵襲從而治療潰瘍性結(jié)腸炎。美腸安聯(lián)合美沙拉嗪治療UC 可能是通過不同抑制IL-1β和CD44的表達(dá)，共同協(xié)同調(diào)節(jié)炎性因子的致病性，促進(jìn)免疫功能的恢復(fù)。

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