血培養(yǎng)分離出龜分枝桿菌的分析

柳青，邱廣斌，翟如波△（中國人民解放軍第二○二醫(yī)院檢驗科，沈陽 0003）

龜分枝桿菌是一種常見的環(huán)境腐生物寄生菌，廣泛分布于自然界，是分枝桿菌醫(yī)源性感染最常見的菌種之一，可引起膿腫、肺部以及傷口感染，主要通過污染的水或手術(shù)器械傳播［1］。近年來，由非典型分枝桿菌引起的感染日益增多，國內(nèi)由于對此病的認(rèn)識不夠，檢查和鑒定方法都較局限，依靠常規(guī)治療結(jié)核病的藥物效果一般都不好，使得治療比較困難［2］。因此，及時、正確的鑒定該菌對臨床治療、控制醫(yī)院內(nèi)的感染流行具有重要意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料患者，男，61歲，2013年5月因無明顯誘因周身紅斑、浮腫加重，伴發(fā)熱，體溫最高37.8℃，自行靜脈應(yīng)用頭孢哌酮、地塞米松（劑量不詳）7d，但發(fā)熱癥狀無緩解，繼而出現(xiàn)四肢皮膚紅腫加重，恥骨聯(lián)合處、左小腿出現(xiàn)水皰，水皰破潰后形成潰瘍，來該院就診。入院時一般狀態(tài)差，雙肺聽診呼吸音弱，右下肺可聞及散在帛裂音，全身皮膚多處硬結(jié)、紅腫及潰瘍，其中硬結(jié)以上腹部較明顯，約6cm×6cm，紅腫處皮溫高，無破潰，無壓痛，以雙前臂、雙腋和兩側(cè)腹部較嚴(yán)重，潰瘍以恥骨聯(lián)合處和左側(cè)小腿內(nèi)側(cè)處較重（左小腿內(nèi)側(cè)可見一大小約16cm×9cm 創(chuàng)面，表面結(jié)少量灰黑色痂皮，有少量滲出，周圍皮膚略有紅腫，恥骨聯(lián)合處可見一大小約12cm×7cm 創(chuàng)面，下連至?xí)幉?，部分皮膚軟組織缺失，滲出較多，周圍皮膚無明顯紅腫，骶尾部可見1cm×1cm 潰瘍）。左側(cè)腋下、左側(cè)腹部靠近髂部紅腫處可見內(nèi)有膿樣液化，觸之內(nèi)有波動感。胸部CT 顯示：雙肺紋理增粗、紊亂，呈網(wǎng)狀及毛玻璃狀改變。B 超檢查提示：有局限性膿腫。病理檢查提示：有結(jié)核樣肉芽腫。微生物學(xué)檢查：多次送檢血培養(yǎng)呈陽性，涂片進行革蘭染色為革蘭陽性桿菌，抗酸染色為陽性。

1.2 儀器與試劑血瓊脂、麥康凱、營養(yǎng)瓊脂、M－H 瓊脂、噻吩－2－羧酸肼（TCH）培養(yǎng)基、對硝基苯甲酸（PNB）培養(yǎng)基、7H12B培養(yǎng)基、5μg／mLα－硝基－α－乙酰氨基－β－羥基苯丙酮（NAP）、硝酸鹽等微量生化管。

1.3 方法血液經(jīng)增菌培養(yǎng)后接種于血瓊脂、麥康凱、營養(yǎng)瓊脂，菌落偶有粗糙型，營養(yǎng)要求不高，普通血瓊脂、麥康凱培養(yǎng)基均可生長。在普通血瓊脂培養(yǎng)基上35℃培養(yǎng)2～5d可見明顯菌落。菌落為無色、圓形、光滑、濕潤、凸起。菌落涂片革蘭染色為陽性，抗酸染色陽性。再傳代培養(yǎng)于噻吩－2－羧酸肼（TCH）培養(yǎng)基和對硝基苯甲酸（PNB）培養(yǎng)基上生長良好；傳代于7H12B培養(yǎng)基內(nèi)，24h可見絮狀生長；傳代于變色液體培養(yǎng)基內(nèi)，24h培養(yǎng)基即可變紫色或紅色，且有紫色菌體沉淀；能耐受5μg／mLα－硝基－α－乙酰氨基－β－羥基苯丙酮（NAP），由此可確定為快速生長分枝桿菌（RGM）。確定后進行芳香硫酸酯酶（3、14d）試驗、硝酸鹽還原試驗、鐵吸收試驗、麥康凱瓊脂生長試驗和30℃、37℃、45℃試驗。除了龜分枝桿菌（類龜分枝桿菌除外）外，其他快速生長分枝桿菌硝酸鹽還原試驗和鐵吸收試驗均為陰性［3］；除了恥垢分枝桿菌和偶發(fā)分枝桿菌Ⅰ型外，其他快速生長分枝桿菌45℃均不能生長；除了恥垢分枝桿菌芳香硫酸酯酶（3d）陰性外，其他快速生長分枝桿菌均為陽性；除了部分龜分枝桿菌龜亞種外，其他均能在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上生長，由此鑒定為龜分枝桿菌。

2 結(jié)果

2.1 涂片結(jié)果血培養(yǎng)提示陽性，將集菌處理后的培養(yǎng)物涂片，進行革蘭染色，鏡下可見革蘭陽性桿菌。同時進行抗酸染色，鏡下可見抗酸陽性桿菌，見圖1、2。

圖1 血標(biāo)本革蘭染色涂片

圖2 血標(biāo)本抗酸染色涂片

2.2 培養(yǎng)結(jié)果用無菌注射器從陽性血培養(yǎng)瓶中，抽取適量血液，接種于血平皿、麥康凱培養(yǎng)基中，置于35℃溫箱內(nèi)，培養(yǎng)3～5d。血平皿上菌落為無色、圓形、光滑、濕潤、凸起。見圖3。

2.3 藥敏結(jié)果選用紙片瓊脂擴散法。培養(yǎng)板在35℃中孵育3～5d，由于藥物不穩(wěn)定性，孵育時間不能超過5d，結(jié)果顯示，阿米卡星抑菌環(huán)為30mm，環(huán)丙沙星抑菌環(huán)為20mm，四環(huán)素抑菌環(huán)為30mm，慶大霉素抑菌環(huán)為20mm，第3代頭孢抑菌環(huán)為6mm，克拉霉素抑菌環(huán)為15 mm，利福平抑菌環(huán)為18mm。推測阿米卡星、慶大霉素、克拉霉素、四環(huán)素敏感，環(huán)丙沙星、利福平中敏，頭孢菌素耐藥。從而判定此菌是一種對多種抗菌藥物耐藥的細菌，藥物敏感性差異較大。

圖3 血平皿上菌落形態(tài)

3 討論

龜分枝桿菌為非結(jié)核分枝桿菌（NTM）Runyon 分類法的第Ⅳ群——快速生長菌（又名快速生長分枝桿菌）。該細菌廣泛存在于土壤和灰塵中，為環(huán)境中最常見的分枝桿菌。菌體為微彎曲或直的桿菌，不同條件下，菌體呈多形態(tài)性，革蘭染色不明顯，多數(shù)情況下為陽性；無莢膜鞭毛不能運動，幼齡菌具有較強的抗酸性，隨著菌齡延長抗酸性減弱；最適生長溫度為25～37℃，能引起局部及全身感染。本菌營養(yǎng)要求不高，在血平皿、麥康凱、營養(yǎng)瓊脂上，35℃均可生長。此菌對一線抗結(jié)核藥物的耐藥性較高，所以臨床上大都采用聯(lián)合用藥。本例患者采取阿米卡星、克拉霉素、頭孢西丁、利福平聯(lián)合用藥，并對膿腫部位進行清創(chuàng)治療。治療一段時間后胸部CT 顯示雙肺紋理較以前清晰，B超檢查提示局限性膿腫縮小，微生物學(xué)檢查表明多次送檢血培養(yǎng)呈陰性。

隨著流行病學(xué)調(diào)查，快速生長分枝桿菌的分離率、臨床感染率和發(fā)病率總體上呈逐漸增多的趨勢，占分枝桿菌菌株總數(shù)的20%左右，與醫(yī)院感染密切相關(guān)［4－6］。此類細菌以龜分枝桿菌、膿腫分枝桿菌、偶發(fā)分枝桿菌為代表。本例患者確診感染龜分枝桿菌，此菌對人類的致病性不高，經(jīng)常是在機體免疫功能低下，或作為繼發(fā)性、伴隨性疾病發(fā)生。感染具有條件性是此菌致病性的一個顯著特點，往往在慢性阻塞性肺病、免疫缺陷或免疫抑制劑、長期激素使用者、臟器移植、腫瘤、老年人中高發(fā)。本例患者就是因患有免疫系統(tǒng)疾病，長期使用免疫抑制劑，導(dǎo)致免疫缺陷，進而繼發(fā)龜分枝桿菌感染，導(dǎo)致敗血癥。

綜上所述，快速生長分枝桿菌感染及發(fā)病，由于耐藥率高以及廣泛，導(dǎo)致臨床可供選擇的藥物較少，因而給治療帶來很大的困難［7－10］。所以加強實驗檢測，及時、準(zhǔn)確鑒定該病原菌，給臨床用藥提供理論支持，臨床根據(jù)藥敏試驗結(jié)果，組合有效的治療方案，才能更好地控制該疾病。

［1］陳升漢.快速生長分枝桿菌病的診斷和治療［J］.中華結(jié)核和呼吸雜志，2000，23（5）：273－274.

［2］鄒曉艷，楊德遠，楊玲.從膿腫及病變組織中檢出龜分枝桿菌［J］.微生物與感染，2013，8（2）：96－97.

［3］葉應(yīng)嫵，王毓三，申子瑜.全國臨床檢驗操作規(guī)程［M］.3版.南京：東南大學(xué)出版社，2006：10.

［4］許蘊怡，李冰，譚耀駒，等.廣州地區(qū)臨床分離非結(jié)核分枝桿菌菌種鑒定及耐藥結(jié)果分析［J］.廣東醫(yī)學(xué)，2011，32（3）：334－336.

［5］劉厚明，詹能勇，陳建波，等.145株非結(jié)核分枝桿菌對10種藥物的耐藥性分析［J］.臨床肺科雜志，2011，16（9）：1390－1392.

［6］李昕潔，譚守勇，黃業(yè)倫，等.812株非結(jié)核分枝桿菌臨床分離株流行病學(xué)特征分析［J］.中國防癆雜志，2010，32（12）：132－133.

［7］吳龍章，陳素穎，曾少芳，等.廣州市12年間分枝桿菌菌型與藥物敏感性結(jié)果變遷的分析［J］.中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2011，45（1）：26－29.

［8］王俊玲，汪志慧，尹詩維.112例非結(jié)核分枝桿菌藥敏耐藥分析［J］.醫(yī)學(xué)檢驗與臨床，2011，22（4）：62－63.

［9］盧家澤，李德憲.51例非結(jié)核分枝桿菌肺病的臨床分析［J］.廣東醫(yī)學(xué)，2010，31（19）：2569－2570.

［10］陳華，陳品儒，肖芃.180株Ⅳ群非結(jié)核分枝桿菌分布及耐藥性分析［J］.廣東醫(yī)學(xué)，2011，32（11）：1433－1435.