miR-145抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌Tca-8113細(xì)胞增殖活性及其與CDK6的靶向關(guān)系

郭 芳，黃 碩

(西安醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)系，西安 710021;*通訊作者，E-mail:guofang198419@163.com)

miRNA是一類(lèi)內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼RNA，其大小長(zhǎng)約20－25個(gè)核苷酸。其不但可以直接發(fā)揮原癌基因或者抑癌基因的作用，而且可以通過(guò)降解靶mRNA或者抑制靶信使RNA(mRNA)的翻譯調(diào)節(jié)其他癌基因或者抑癌基因的表達(dá)［1，2］。據(jù)報(bào)道，miRNA 在人類(lèi)的各種生物過(guò)程均發(fā)揮重要作用，如新陳代謝、分化、細(xì)胞增殖和凋亡［3］。microRNA已被證實(shí)與癌癥的發(fā)生和發(fā)展是密切相關(guān)的，其可能成為癌癥診斷的新的生物學(xué)標(biāo)記物［4］。

研究表明，miR-145 在調(diào)節(jié)干細(xì)胞分化［5，6］、多種惡性腫瘤(如結(jié)腸癌［7］、前列腺癌［8］、乳腺癌［9］、宮頸癌［10］等)的發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。有關(guān)miR-145在口腔鱗狀細(xì)胞癌中的研究報(bào)道尚少。本研究通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)miR-145的靶基因，構(gòu)建pcDNATM6.2-GW-pre-miR-145重組表達(dá)質(zhì)粒，通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因預(yù)測(cè)miR-145對(duì)下游靶基因CDK6表達(dá)的影響，以及對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

pcDNATM6.2-GW、pmirGLO真核載體、口腔鱗狀細(xì)胞癌Tca-8113細(xì)胞株、E.coli DH5α均由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)中心提供。

T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶(Hin dⅢ、Eco RⅠ、SacⅠ和 XhoⅠ)、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScript3?RT)均購(gòu)自Takara公司(大連)，質(zhì)粒抽提、凝膠回收試劑盒購(gòu)自Qiagen公司，RNA抽提試劑Trizol轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000購(gòu)自美國(guó)vitrogen公司，RIPA、SDSPAGE凝膠配制試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司，PVDF膜、蛋白發(fā)光液購(gòu)自Millipore公司，鼠抗人βactin購(gòu)自Santa Cruz公司，兔抗人CDK6購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Promega公司，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 方法

1.2.1 miR-145表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定 從miRBase網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索has-miR-145的pre-miR-145頸環(huán)序列，設(shè)計(jì)合成兩端帶有Hin dⅢ和Eco RⅠ酶切位點(diǎn)的互補(bǔ)雙鏈DNA，序列交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，一條為 AAT TCCACCTTGTCCTCACGGTCCAGTTTTCCCAGGAATC CCTTAGATGCTAAGATGGGGATTCCTGGAAATACTG TTCTTGAGGTCATGGTTA，另一條為AGCTTAACCAT GACCTCAAGAACAGTATTTCCAGGAATCCCCATCTT AGCATCTAAGGGATTCCTGGGAAAACTGGACCGTGA GGACAAGGTGG。Hin dⅢ和Eco RⅠ雙酶切質(zhì)粒載體pcDNATM6.2-GW，用T4DNA連接酶連接線性化質(zhì)粒載體與目的基因退火片段，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌E.coli DH5α，挑取單個(gè)克隆后采用含壯觀霉素的LB培養(yǎng)基篩選擴(kuò)增，12-16 h后提取質(zhì)粒送生工生物工程(上海)股份有限公司對(duì)重組質(zhì)粒pcDNATM6.2-GW-premiR-145進(jìn)行測(cè)序鑒定。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR(qRT-PCR)驗(yàn)證 miR-145在Tca-8113細(xì)胞中的表達(dá) 將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒 pcDNATM6.2-GW-pre-miR-145轉(zhuǎn)染 Tca-8113細(xì)胞，然后采用qRT-PCR檢測(cè)成熟miR-145的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)分組:miR-145組為轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pcDNATM6.2-GW-pre-miR-145;control組為未作處理的Tca-8113細(xì)胞;miR－145的逆轉(zhuǎn)錄引物序列GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTG GATACGACAGGGATT，上游引物為:5’－CAGTGCGTGTCGTGGAGT－3’，下游引物為:5’－AGGTCCAGTTTTCCCAGG－3’，U6作為內(nèi)參。使用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ進(jìn)行擴(kuò)增，條件:95℃，1 min預(yù)變性，95℃變性10 s，60℃退火，延伸40 s，重復(fù)40個(gè)循環(huán)，采用2－ΔΔCt計(jì)算miR-145表達(dá)量。

1.2.3 MTT檢測(cè)miR-145對(duì)Tca-8113細(xì)胞增殖的影響 Tca-8113細(xì)胞采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，放置于37℃，5%CO2的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。96孔板每孔約3 000個(gè)細(xì)胞，采用Lipofectamine2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)分組:miR-145組為轉(zhuǎn)染pcDNATM 6.2-GW-pre-miR-145重組質(zhì)粒;Neg-miR-145組為轉(zhuǎn)染pcDNATM6.2-GW空質(zhì)粒;各組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，于轉(zhuǎn)染后24 h、48 h、72 h后加入20μl，37℃孵育4 h后棄上清，加入150μl后于492 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)Tca-8113細(xì)胞的吸光度值。

1.2.4 熒光素酶報(bào)告基因載體的構(gòu)建與鑒定 采用targetscan(http://www.targetscan.org/)根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則選取miR-145的候選靶基因CDK6，分別于CCAATAATCCTTTGGAAACTGGATC及其互補(bǔ)鏈TCGAGATCCAGTTTCCAAAGGATTATTGGAGCT兩側(cè)添加SacⅠ和XhoⅠ雙酶切位點(diǎn)，命名為野生型CDK6(WT-CDK6)，同時(shí)在種子區(qū)設(shè)計(jì)突變型CDK6(MT-CDK6)，堿基序列由公司加工合成，并采用Annealing Buffer退火為雙鏈，并連接于pmirGLO真核表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)化與測(cè)序方法和miR-145相一致。

1.2.5 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)miR-145對(duì)CDK6的靶向作用 收集對(duì)數(shù)期的Tca-8113細(xì)胞，鋪于96孔板，每孔約4×103個(gè)細(xì)胞，設(shè)4組、每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，24 h后分別轉(zhuǎn)染Neg-miR(pcDNATM6.2-GW空質(zhì)粒)+WT-CDK6，Neg-miR+MT-CDK6，miR-145+WT-CDK6，miR-145+MT-CDK6。24h后，根據(jù)Promega公司雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)添加螢火蟲(chóng)和海腎熒光素酶試劑上機(jī)檢測(cè)。

1.2.6 Western blot檢測(cè) miR-145 對(duì) CDK6 蛋白表達(dá)的調(diào)控 實(shí)驗(yàn)分組同MTT，轉(zhuǎn)染24 h后胰酶消化細(xì)胞后采用PBS洗2遍后收集Tca-8113細(xì)胞，采用RIPA裂解液按照操作說(shuō)明提取蛋白，配置10%的SDS-PAGE凝膠，每孔20μg蛋白量上樣、電泳，室溫下5%脫脂牛奶封閉2 h，一抗(CDK6 1∶100;β-actin 1∶3 000)4 ℃孵育過(guò)夜，二抗室溫下孵育1.5 h，TBST洗膜，化學(xué)發(fā)光觀察蛋白的表達(dá)情況。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，P＜0.05時(shí)認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 成功構(gòu)建miR-145表達(dá)載體

Hin dⅢ和Eco RⅠ雙酶切質(zhì)粒載體pcDNATM6.2-GW與退火成雙鏈的pre-miR-145相連接后，將重組的miR-145真核表達(dá)載體進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明重組的pcDNATM6.2-GW-pre-miR-145真核表達(dá)載體無(wú)堿基序列的突變與丟失。采用qRT-PCR檢測(cè)miR-145在miR-145組與control組中的表達(dá)，結(jié)果顯示miR-145組中miR-145的表達(dá)顯著高于內(nèi)源性表達(dá)量(P＜0.001，見(jiàn)圖1)。

圖1 qRT-PCR檢測(cè)miR-145在miR-145組與control組中的表達(dá)Figure 1 The expression of miR-145 in miR－145 group and control group using qRT-PCR

2.2 miR-145能夠抑制Tca-8113細(xì)胞的增殖

將 pcDNATM6.2-GW-pre-miR-145 和 pcDNATM 6.2-GW空載體分別轉(zhuǎn)染口腔鱗狀細(xì)胞癌Tca-8113細(xì)胞;如圖2所示，轉(zhuǎn)染miR-145的 Tca-8113細(xì)胞的增殖活性明顯低于空載體組(P＜0.01)，表明miR-145能夠明顯抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌Tca-8113細(xì)胞的增殖。

2.3 miR-145能夠靶向下調(diào)CDK6的表達(dá)

通過(guò)Targetscan預(yù)測(cè)miR-145與CDK6間存在良好的堿基互補(bǔ)配對(duì)，在此基礎(chǔ)上成功構(gòu)建CDK6野生型(WT-CDK6)及突變型(MT-CDK6)真核表達(dá)載體(圖3)，與miR-145和Neg-miR共轉(zhuǎn)染Tca-8113細(xì)胞。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)顯示共同轉(zhuǎn)染miR-145+WT-CDK6后，熒光素酶活性表達(dá)明顯受到抑制，而轉(zhuǎn)染 Neg-miR+WT-CDK6，Neg-miR+MT-CDK6，miR-145+MT-CDK6組的熒光素酶活性無(wú)明顯變化。結(jié)果表明，miR-145與CDK6之間存在良好的靶向關(guān)系(P=0.002，見(jiàn)圖4)。

圖2 MTT法檢測(cè)Neg-miR組與miR-145組的細(xì)胞增殖情況Figure 2 Cell proliferation in Neg-miR group and miR-145 group by MTT

圖3 Targetscan預(yù)測(cè)miR-145與CDK6堿基互補(bǔ)情況及突變位點(diǎn)Figure 3 Predicted miR-145 and CDK6 complementary base and mutations in Targetscan

圖4 雙熒光素酶報(bào)告基因分析結(jié)果Figure 4 Dual-Luciferase reporter assay results

2.4 miR-145能夠抑制內(nèi)源性CDK6蛋白的表達(dá)

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染 pcDNATM 6.2-GW-pre-miR-145的Tca-8113細(xì)胞其下游CDK6的蛋白表達(dá)水平顯著低于轉(zhuǎn)染pcDNATM 6.2-GW空載體的 Tca-8113細(xì)胞，表明miR-145能夠抑制Tca-8113細(xì)胞中CDK6的蛋白表達(dá)水平(見(jiàn)圖5)。

圖5 Western blot檢測(cè)miR-145對(duì)CDK6蛋白表達(dá)的調(diào)控Figure 5 The regulation of miR-145 to CDK6 protein expression by Western blot

3 討論

2003年世界口腔健康統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示口腔鱗狀細(xì)胞癌占口腔惡性腫瘤的90%以上，口腔鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)病率在26種主要惡性癌癥中位居第八位，盡管隨著手術(shù)技術(shù)和基礎(chǔ)研究的進(jìn)步，包括手術(shù)為主，放療和化療在內(nèi)的綜合治療，使其5年死亡率已經(jīng)明顯下降，但是仍然是癌癥死亡的主要疾病之一。因此，尋找新的生物標(biāo)志物和探索新的治療靶點(diǎn)，對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞癌的診斷和治療具有重要意義。

近年來(lái)，microRNA是一個(gè)研究熱點(diǎn)，其廣泛存在于生物體內(nèi)，是一類(lèi)長(zhǎng)度在19-25 bp、高度保守的非編碼小RNA，是具有莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)的單鏈RNA分子。miRNA以序列特異性的方式調(diào)節(jié)基因表達(dá)，在動(dòng)植物發(fā)育、細(xì)胞凋亡、代謝以及疾病發(fā)生等方面都起著重要作用，從而受到廣泛關(guān)注。生物信息學(xué)研究發(fā)現(xiàn)microRNA只有人類(lèi)基因總數(shù)的2%，卻調(diào)節(jié)著人類(lèi)全基因組中30%以上的基因表達(dá)［11］，因此，其可以成為一個(gè)比較穩(wěn)定的抗癌靶點(diǎn)。

Kozaki等［12］檢測(cè)了 148 個(gè) miRNAs在 18 個(gè)口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系中的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中有54個(gè)miRNAs表達(dá)下調(diào)，11個(gè)miRNAs表達(dá)上調(diào)。原癌基因miRNAs常在腫瘤組織中的表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展;相反，抑癌基因miRNAs常表達(dá)下調(diào)，減少或消除對(duì)腫瘤發(fā)展的抑制作用。miR-145定位于染色體5q32-33，被發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中低表達(dá)，如直腸癌、膀胱癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、胃癌、食管癌、鼻咽癌、卵巢癌、骨肉瘤、宮頸癌、胰腺癌、尤文氏肉瘤等，且通過(guò)作用于多個(gè)靶基因來(lái)抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮類(lèi)似于抑癌基因的作用。如Chiyomaru等［13］研究發(fā)現(xiàn)在膀胱癌中miR-145可以作為抑癌基因下調(diào)FSCN1的mRNA和蛋白表達(dá)。Wang等［14］發(fā)現(xiàn)在乳腺癌MCF-7細(xì)胞中過(guò)表達(dá)的miR-145可以抑制RTKN蛋白表達(dá)以及其mRNA水平，并且miR-145過(guò)表達(dá)質(zhì)?？梢砸种芃CF-7細(xì)胞生長(zhǎng)并誘導(dǎo)其凋亡。miR-145能抑制前列腺癌PC-3細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡，促使細(xì)胞周期阻滯并抑制其侵襲轉(zhuǎn)移，起到抑癌基因的作用。但是miR-145在口腔鱗狀細(xì)胞癌中的相關(guān)研究目前報(bào)道較少。

為了研究miR-145在口腔鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展的作用機(jī)制，本研究通過(guò)構(gòu)建miR-145真核表達(dá)載體，將構(gòu)建成功的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染Tca-8113細(xì)胞系，并采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)miR-145的含量，結(jié)果顯示miR-145組中miR-145的表達(dá)顯著高于未作處理的Tca-8113組。為了進(jìn)一步研究miR-145的過(guò)表達(dá)對(duì)Tca-8113細(xì)胞增殖活性的影響，我們采用MTT法進(jìn)行了檢測(cè)，將 pcDNATM6.2-GW-pre-miR-145和pcDNATM6.2-GW空載體分別轉(zhuǎn)染口腔鱗狀細(xì)胞癌 Tca-8113，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染 miR-145的 Tca-8113細(xì)胞的增殖活性明顯低于空載體組(P＜0.01)，表明miR-145能夠抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌Tca-8113細(xì)胞的增殖。

我們對(duì)miR-145抑制Tca-8113細(xì)胞增殖的機(jī)制進(jìn)行了初步探討，生物信息學(xué)軟件是預(yù)測(cè)miRNAs靶基因的重要方法之一。目前被證實(shí)的miRNA靶基因均是以生物信息學(xué)的預(yù)測(cè)為基礎(chǔ)的。首先，通過(guò)生物信息學(xué)的方法預(yù)測(cè)miR-145可能作用的靶基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CDK6可能是miR－145的候選靶基因。為了對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證，本研究采用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明共同轉(zhuǎn)染miR-145和WT-CDK6后，熒光素酶活性表達(dá)明顯受到抑制，說(shuō)明miR-145能夠?qū)ca-8113細(xì)胞中的CDK6基因起到抑制性的調(diào)控作用。Western blot結(jié)果表明miR-145能夠抑制Tca-8113細(xì)胞中CDK6的蛋白表達(dá)水平，進(jìn)一步驗(yàn)證了二者之間的靶向關(guān)系。

綜上所述，在口腔鱗狀細(xì)胞癌中，miR-145的過(guò)表達(dá)可以顯著抑制Tca-8113細(xì)胞的增殖活性，同時(shí)可以靶向CDK6引起其蛋白表達(dá)水平的下調(diào)，而CDK6作為一個(gè)周期蛋白，又與細(xì)胞的增殖密切相關(guān)，因此，本研究初步推測(cè)miR-145可能通過(guò)靶向CDK6引起口腔鱗狀細(xì)胞癌Tca-8113細(xì)胞的增殖活性，這也為我們后期進(jìn)一步的機(jī)制研究奠定了一定的理論基礎(chǔ)。

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