非小細(xì)胞肺癌中EPHB6基因突變的篩選和功能預(yù)測(cè)

于 軍，鐵 茹，趙 鴿，張學(xué)策，陳寶瑩

(1西安醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，西安 710038;2第四軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心;3西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院麻醉科;4第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院放射科;*通訊作者，E-mail:chenby128@163.com)

非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是肺癌的主要病理類型［1］，而遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移是NSCLC患者的主要死亡原因。受體型酪氨酸蛋白激酶(receptor tyrosine kinases，RTKs)在NSCLC 的轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要的作用［2］。EPH是RTKs中最大的一個(gè)亞家族，分為EPHA受體1-10(EPHA1-A10)和EPHB受體1-6(EPHB1-B6)。EPHB6受體與其配體Ephrin相互作用。當(dāng)與其配體Ephrin相互作用后，EPH受體調(diào)控一系列的細(xì)胞生物學(xué)行為，包括細(xì)胞與細(xì)胞的相互作用、細(xì)胞遷移等，EPHB6缺失與晚期的NSCLC和癌癥的進(jìn)展密切相關(guān)［3，4］。DNA 分子中發(fā)生堿基的替換、增添和缺失而引起的基因結(jié)構(gòu)的改變，即基因突變。腫瘤的發(fā)生是一個(gè)從突變的積累到選擇進(jìn)化，再到克隆起源的過程。雖然了解克隆的選擇過程比較困難，但分析基因突變和腫瘤發(fā)生的關(guān)聯(lián)將非常有助于研究細(xì)胞惡變的分子機(jī)制。借助于技術(shù)上的進(jìn)步，近年來，科學(xué)家試圖通過高通量基因測(cè)序的方法，篩查與腫瘤發(fā)生和發(fā)展相關(guān)的基因突變。鑒于其重要的生物學(xué)功能，EPHB6成為此類研究中重要的篩查基因之一。本研究通過測(cè)序篩查EPHB6編碼區(qū)的序列，并通過生物信息學(xué)分析，結(jié)合體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)其功能性作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

原發(fā)的腫瘤標(biāo)本和癌旁的正常組織手術(shù)取自80例NSCLC患者(標(biāo)本來自2000-2013年第四軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院胸外科手術(shù))，組織采用液氮速凍，并保存于液氮之中。對(duì)于腫瘤標(biāo)本行組織學(xué)鑒定，只有活檢顯示腫瘤細(xì)胞多于70%的組織才用于后續(xù)分析。癌旁正常組織也采用組織學(xué)檢測(cè)鑒定。所有患者都簽署知情同意書，本研究得到西安醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 EPHB6基因測(cè)序 采用DNAzol(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)抽提基因組 DNA。用 Primer 3軟件設(shè)計(jì)引物，用于PCR擴(kuò)增400-800 bp的片段，涵蓋EPHB6完整的編碼區(qū)［5］。雙側(cè)的DNA鏈采用PCR引物測(cè)序。測(cè)序BigDye Terminator V3.1 Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems)，在 ABI3730xl自動(dòng)DNA測(cè)序儀上完成。測(cè)序得到的EPHB6編碼區(qū)序列與參考序列(GenBank accession No.NM_004445)進(jìn)行比對(duì)。

1.2.2 生物信息學(xué)分析 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)同時(shí)采用兩種預(yù)測(cè)工具，分別是SIFT(Sort Intolerant from Tolerant，http://sift.bii.a-star.edu.sg/)和 Poly-Phen-2(Polymorphism Phenotype，http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/)。操作按照預(yù)測(cè)系統(tǒng)的說明進(jìn)行。SIFT的預(yù)測(cè)得分小于0.05，認(rèn)為是有害突變;PolyPhen-2將突變分為有害、可能有害和無害3類。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC中頻發(fā)EPHB6突變

本研究通過對(duì)EPHB6整個(gè)編碼區(qū)的測(cè)序，發(fā)現(xiàn)80例NSCLC患者中有3例(3.8%)存在EPHB6的有義突變(R52C，Q498H，915-917del各 1例)，而在3種NSCLC的細(xì)胞系A(chǔ)549、HTB56和HTB58中均未檢測(cè)到EPHB6的突變。EPHB6編碼區(qū)的結(jié)構(gòu)圖見圖1(見第667頁(yè))，R52C和Q498H分別位于Ephrin配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域和FN3結(jié)構(gòu)域。而缺失突變915-917del，位于EPHB6的酪氨酸激酶催化結(jié)構(gòu)域(Tyrkc)和sterile alpha基序(SAM)之間。與結(jié)直腸癌中報(bào)道的點(diǎn)突變(D915G和G914V)相毗鄰［6，7］。提示，該區(qū)域可能對(duì)于EPHB6的功能具有重要的意義。

2.2 突變可能造成EPHB6功能受損

目前已知的所有的EPHB6的體突變位點(diǎn)，共計(jì)26個(gè)。從組織病理學(xué)分類來看，3個(gè)突變位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)于神經(jīng)膠質(zhì)瘤，5個(gè)位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)于結(jié)直腸癌，9個(gè)位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)于肺癌(其中R52C、Q498H和915_917del是我們首次篩查得到的)，2個(gè)位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)于卵巢癌，6個(gè)位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)于黑色素瘤，1個(gè)位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)于胃癌?？梢?，肺癌中頻發(fā)EPHB6突變。從結(jié)構(gòu)域分布上來看，9個(gè)突變位點(diǎn)位于TyrKc激酶催化結(jié)構(gòu)域，8個(gè)突變位點(diǎn)位于Ephrin配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，2個(gè)位于FN3結(jié)構(gòu)域，7個(gè)位于相鄰結(jié)構(gòu)域的連接處?？梢?，EPHB6編碼區(qū)的各個(gè)部位都可能發(fā)生突變。由于EPHB6基因的高度保守性，提示EPHB6突變?cè)谀[瘤發(fā)生、發(fā)展中可能具有重要的功能性作用。

SIFT與Polyphen是比較權(quán)威的基因突變預(yù)測(cè)分析系統(tǒng)，研究者可以通過在線的方式對(duì)已知的突變位點(diǎn)進(jìn)行功能預(yù)測(cè)。SIFT將分值小于0.05的突變界定為有害突變，Polyphen-2將突變分為三類:“probably damaging”、“possibly damaging”和“benign。SIFT與 Polyphen對(duì)于目前所有已知的EPHB6體突變預(yù)測(cè)的結(jié)果見表1。其中，SIFT預(yù)測(cè)有害突變11個(gè)，Polyphen-2預(yù)測(cè)有害突變15個(gè)，SIFT和Polyphen-2同時(shí)預(yù)測(cè)有害的突變8個(gè)，分別為:A685T(神經(jīng)膠質(zhì)瘤)、D345N(結(jié)直腸癌)、A203D(肺癌)、R52C(肺癌)、P728H(肺癌)、P728S(卵巢癌)、L21F(卵巢癌)、R704W(黑色素瘤)。

3 討論

本研究中我們首次在NSCLC中鑒定得到EPHB6的新的體突變位點(diǎn)R52C、Q498H和915-917del，證明NSCLC中頻發(fā)EPHB6突變。通過生物信息學(xué)分析的方法，預(yù)測(cè)了目前已知的EPHB6突變的功能，為下一步的功能學(xué)實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。

EPH作為受體型酪氨酸蛋白激酶中最大的一個(gè)亞家族，其突變?cè)谀[瘤當(dāng)中的發(fā)生比較頻繁。一項(xiàng)大樣本的測(cè)序研究發(fā)現(xiàn)肺腺癌中有10種EPH基因發(fā)生了突變［8］。由于EPH相關(guān)細(xì)胞信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性，對(duì)于EPH突變的功能性作用及其后果還知之甚少［9］。EPHB6 的體突變位點(diǎn)在肺癌［8］、結(jié)直腸癌［6，7］、卵巢癌［10］和神經(jīng)膠質(zhì)瘤［7］中以往都有報(bào)道，但突變的功能不明。

本研究篩查了80例NSCLC患者和3例NSCLC細(xì)胞系，首次發(fā)現(xiàn)3個(gè)EPHB6的未報(bào)道過的突變位點(diǎn)。其中，缺失突變del915-917位于酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域與SAM結(jié)構(gòu)域之間。此區(qū)域最近在結(jié)直腸癌中也報(bào)道有體突變發(fā)生［6，7］。提示，此區(qū)域可能與腫瘤密切相關(guān)。

表1 發(fā)現(xiàn)于腫瘤組織的EPHB6(NM_004445和NP_004436)的所有有義體突變Table 1 All somatic mutations of EPHB6(NM_004445和NP_004436)found in tumor tissues

本研究采用的SIFT與Polyphen是比較權(quán)威的基因突變預(yù)測(cè)分析系統(tǒng)，研究者可以通過在線的方式對(duì)已知的突變位點(diǎn)進(jìn)行功能預(yù)測(cè)。但是，這兩個(gè)系統(tǒng)僅能預(yù)測(cè)點(diǎn)突變位點(diǎn)，對(duì)于缺失突變，例如本研究篩查到的915_917del不能預(yù)測(cè)。鑒于目前已知的大多數(shù)EPHB6突變均為點(diǎn)突變，我們對(duì)這些突變位點(diǎn)分別采用SIFT與Polyphen-2進(jìn)行了預(yù)測(cè)分析。本研究顯示，肺癌當(dāng)中可能的EPHB6有害突變較多，且包括本研究新篩查到的R52C。其確切的生物學(xué)效應(yīng)還需要功能性實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步證實(shí)。

推測(cè)EPHB6突變不但造成EPHB6原有的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制效應(yīng)消失，更重要的是其突變體具有促發(fā)腫瘤轉(zhuǎn)移的作用。其中一種可能的機(jī)制為突變體通過“dominant negative”的方式對(duì)野生型EPHB6產(chǎn)生抑制效應(yīng)。另外，突變體還可能激活促轉(zhuǎn)移的信號(hào)通路及其網(wǎng)絡(luò)。但這需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

在腫瘤當(dāng)中，EPHB6既存在“質(zhì)”變，又存在“量”變。我們以往報(bào)道EPHB6存在表觀遺傳學(xué)調(diào)控，即“量”變，EPHB6在NSCLC中具有甲基化沉默現(xiàn)象，即其啟動(dòng)子區(qū)高甲基化造成其表達(dá)水平降低，并且EPHB6的低表達(dá)與腫瘤的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本研究證實(shí)EPHB6突變促發(fā)NSCLC轉(zhuǎn)移，則表明EPHB6存在遺傳學(xué)調(diào)控，造成其“質(zhì)”變，即產(chǎn)生結(jié)構(gòu)和功能異常的蛋白。抓住“質(zhì)”和“量”這兩條線，將有利于闡明EPHB6與NSCLC轉(zhuǎn)移的功能性聯(lián)系，為NSCLC的轉(zhuǎn)移尋找新的突破點(diǎn)。

總之，NSCLC中多發(fā)EPHB6突變，并且EPHB6突變會(huì)導(dǎo)致NSCLC細(xì)胞產(chǎn)生利于遷移的表型。這可能歸因于突變導(dǎo)致的EPHB6原有抗轉(zhuǎn)移功能的缺失，也可能是突變體具有新的促轉(zhuǎn)移功能。其確切機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

［1］Siegel R，Ma J，Zou Z，etal.Cancer statistics，2014 ［J］.CA Cancer J Clin，2014，64:9-29.

［2］Liu SV，Subramaniam D，Cyriac GC，etal.Emerging protein kinase inhibitors for non-small cell lung cancer［J］.Expert Opin Emerg Drugs，2014，19:51-65.

［3］Giaginis C，Tsoukalas N，Bournakis E，etal.Ephrin(Eph)receptor A1，A4，A5 and A7 expression in human non-small cell lung carcinoma:associations with clinicopathological parameters，tumor proliferative capacity and patients＇survival［J］.BMCClin Pathol，2014 ，14(1):8.

［4］Boyd AW，Bartlett PF，Lackmann M.Therapeutic targeting of EPH receptors and their ligands［J］.Nat Rev Drug Discov，2014，13:39-62.

［5］Ralser M，Querfurth R，Warnatz HJ，etal.An efficient and economic enhancer mix for PCR ［J］.Biochem Biophys Res，2006，347:747-751.

［6］Gylfe AE，Sirki?J，Ahlsten M，etal.Somatic mutations and germline sequence variants in patients with familial colorectal cancer［J］.Int JCancer，2010，127:2974-2980.

［7］Balakrishnan A，Bleeker FE，Lamba S，etal.Novel somatic and germline mutations in cancer candidate genes in glioblastoma，melanoma，and pancreatic carcinoma［J］.Cancer Res，2007，67:3545-3550.

［8］Ding L，Getz G，Wheeler DA，etal.Somatic mutations affect key pathways in lung adenocarcinoma［J］.Nature，2008，455:1069-1075.

［9］Pasquale EB.Eph receptors and ephrins in cancer:bidirectional signaling and beyond ［J］.Nat Rev Cancer，2010，10:165-180.

［10］Greenman C，Stephens P，Smith R，etal.Patterns of somatic mutation in human cancer genomes［J］.Nature，2007，446:153-158.