DHA對小鼠急性肺損傷的保護作用及可能的機制研究

史紅陽，李滿祥，劉 昀，方 萍，和 平，張德信

(西安交通大學第二附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，西安 710004)

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是各種直接和間接致傷因素導致的肺泡上皮細胞及毛細血管內(nèi)皮細胞損傷，造成彌漫性肺間質(zhì)及肺泡水腫，導致急性低氧性呼吸功能不全［1］。其具體的病理機制包括炎癥反應(yīng)與抗炎反應(yīng)的失衡，氧化反應(yīng)與抗氧化反應(yīng)的失衡，進而導致了一系列的病理改變［2］。盡管有多項研究及臨床試驗，但是目前尚無有效的干預(yù)措施，ALI死亡率極高［3］。因此急需尋找有效的治療藥物或者新的方法治療急性肺損傷。

二十二碳六烯酸(docosahexaenoicacid，DHA)是人體所必需的一種omega－3多不飽和脂肪酸，來源于魚油和微藻油，對人體生理功能的正常發(fā)揮及多種疾病的防治有著重要作用。近年來多項研究證明攝入DHA可發(fā)揮顯著的抗氧化、抗炎及免疫調(diào)節(jié)的作用，能顯著緩解相關(guān)動物模型疾?。?－7］。提示DHA對相關(guān)疾病的發(fā)病機制具有抑制作用。尚未發(fā)現(xiàn)DHA對LPS誘導的急性肺損傷的相關(guān)保護作用。本研究旨在探索DHA是否具有抑制LPS誘導的急性肺損傷發(fā)病的作用，并且進一步研究DHA改善LPS誘導小鼠急性肺損傷的潛在機制，以期為急性肺損傷的治療提供新的方式和策略。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑

BALB/c小鼠由西安交通大學醫(yī)學部動物實驗中心提供。二十二碳六烯酸和脂多糖(lipopolysaccharide，LPS，Escherichia coli 055:B5)購于美國 Sigma－Aldrich公司。髓過氧化物酶(MPO)測試盒購于南京建成生物工程研究所。IL-1β、IL-6、IL-10檢測試劑盒為R＆D Systems ELISA試劑盒。

1.2 實驗方法

1.2.1 模型制作和實驗分組 6－8周齡BALB/c小鼠(20－25 g)18只隨機分3組:①對照組，氣管內(nèi)滴注PBS;②LPS模型組，氣管內(nèi)滴注LPS(100 μg/50μl)，作用6h;③DHA組，連續(xù)給予DHA(500 mg/kg)灌胃連續(xù)預(yù)處理7 d［5］，再氣管內(nèi)滴注 LPS(100μg/50μl)作用6 h;小鼠均在西安交通大學醫(yī)學部動物中心SPF級動物房飼養(yǎng)，LPS氣道滴注6 h后處死小鼠。

1.2.2 收集支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)LPS作用6 h后處死小鼠，利用氣管內(nèi)注射的方式收集BALF，利用0.8 ml預(yù)冷的PBS進行支氣管肺泡灌洗，每只小鼠灌洗3次，BALF的回收率超過85%。BALF在4℃、1 000×g，離心5 min。分別收集沉淀和上清，BALF上清液在－80℃保存?zhèn)溆?。離心后的細胞沉淀用PBS重新懸浮，利用細胞計數(shù)板進行白細胞計數(shù)。

1.2.3 肺組織病理學檢查 取完整的左肺組織在10%中性緩沖福爾馬林溶液中固48 h，常規(guī)石蠟包埋、切片，蘇木精－伊紅染色。顯微鏡下觀察肺組織病理學變化。

1.2.4 肺泡灌洗液中 IL-1β、IL-6、IL-10 濃度檢測支氣管肺泡灌洗液上清中IL-1β、IL-6、IL-10的濃度利用ELISA檢測，操作步驟按照試劑盒說明進行。

1.2.5 髓過氧化物酶(MPO)活性檢測 總 MPO活性是中性粒細胞功能標志和啟動標志，肺組織內(nèi)中性粒細胞大量聚集可導致MPO活性明顯升高。稱取一定量肺組織，加入5倍體積預(yù)冷的生理鹽水，利用超聲法制作組織勻漿，利用MPO測定試劑盒在460 nm波長處進行比色測定，從而推算出MPO的活力，反映炎癥的嚴重程度。

2 結(jié)果

2.1 DHA對肺組織病理改變的影響

與對照組相比，氣道內(nèi)滴注LPS6h后，肺泡腔及間質(zhì)內(nèi)大量出血，肺泡間隔水腫增厚，大量炎癥細胞浸潤，部分肺泡腔不張，肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)被完全破壞，而應(yīng)用DHA預(yù)處理后上述病理改變明顯減輕(圖1，見第667 頁)。

2.2 DHA對小鼠肺組織浸潤炎癥細胞數(shù)的影響

如圖2所示，與對照組相比，氣道內(nèi)滴注LPS6h后，BALF中的炎癥細胞數(shù)顯著升高(P＜0.01)，與之相伴隨的是肺組織內(nèi)代表中性粒細胞聚集數(shù)目的MPO活性顯著升高(P＜0.01)，而應(yīng)用DHA連續(xù)預(yù)處理小鼠7 d后，上述改變被顯著抑制。

2.3 DHA對小鼠肺組織分泌細胞因子的影響

如圖3所示，氣道內(nèi)滴注LPS6h后，BALF中IL-1β、IL-6的濃度與對照組相比顯著升高(P＜0.01)，保護性細胞因子IL-10較對照組有所升高，但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。而應(yīng)用DHA連續(xù)灌胃預(yù)處理小鼠7 d后，BALF中IL-1β、IL-6濃度顯著下降，保護性細胞因子IL-10顯著升高，與LPS模型組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。

3 討論

當機體遭遇各種炎性刺激(如LPS)后，可釋放各類炎性介質(zhì)(如IL-1β、IL-6等促炎性細胞因子)，促進組織水腫和損傷［8，9］。而藥物干預(yù)上述促炎性細胞因子的分泌可顯著改善動物模型肺損傷［8－10］。本研究中得出了相同的結(jié)論，在LPS干預(yù)組小鼠IL-1β、IL-6顯著升高，同時BALF中的白細胞數(shù)目也明顯升高，而DHA預(yù)處理后可顯著抑制白細胞的浸潤及促炎細胞因子的分泌，提示DHA預(yù)處理可顯著抑制LPS誘導小鼠急性肺損傷組織病理改變。同時本研究提示DHA預(yù)處理可顯著減輕LPS誘導小鼠急性肺損傷炎癥細胞的浸潤。

IL-10作為人體內(nèi)重要的抗炎因子，可抑制炎性反應(yīng)，重建抗炎反應(yīng)和炎癥反應(yīng)的平衡，如抗炎因子分泌量少，不足以對抗炎性因子所導致的炎癥反應(yīng)，則會導致炎癥細胞大量浸潤、組織水腫、器官功能損害，并增加患者的死亡率。研究發(fā)現(xiàn)，因ARDS死亡患者的疾病初期，其肺泡灌洗液中的IL-10濃度較低，推測IL-10不足可能是導致促炎因子生成增多以及肺內(nèi)炎癥反應(yīng)加劇的原因之一［11，12］。進一步研究發(fā)現(xiàn)吸入IL-10可顯著抑制TNF-α、IL－1β及IL-6的分泌從而對急性肺損傷動物模型發(fā)揮保護作用［13，14］。在本研究中DHA預(yù)處理顯著促進了IL-10的分泌，改善了急性肺損傷。

既往研究發(fā)現(xiàn)DHA可通過多種機制抑制疾病的發(fā)生發(fā)展。Camuesco等［15］研究發(fā)現(xiàn) DHA可通過抑制TNF-α、IL-1β的分泌及MPO的活性，顯著改善由5%葡聚糖硫酸鈉誘導的大鼠結(jié)腸炎。Chen等［6］研究發(fā)現(xiàn) DHA 可通過抑制 NF-κB 和 TGF-β/Smad信號通路，減輕膽汁淤積性肝損傷。Tiesset等［16］研究發(fā)現(xiàn)DHA可通過調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和抗炎反應(yīng)，從而對銅綠假單胞菌所致的肺部感染發(fā)揮保護作用。上述多個體內(nèi)體、外實驗研究表明DHA對實驗動物的多個器官炎癥反應(yīng)及功能障礙起抑制作用，提示DHA對上述疾病具有一定的治療作用。本實驗顯示了相同的結(jié)果。DHA通過抑制促炎性細胞因子IL-1β、IL-6的分泌，同時促進保護性細胞因子IL-10的分泌，使促炎反應(yīng)與抗炎反應(yīng)達到再平衡，進而對急性肺損傷發(fā)揮保護作用。提示DHA可抑制急性肺損傷小鼠促炎性細胞因子的分泌，促進抗炎性細胞因子的分泌，促進促炎反應(yīng)與抗炎反應(yīng)的平衡，從而對急性肺損傷發(fā)揮保護作用。

本研究證明了DHA可促進抗炎性細胞因子IL－10的分泌，抑制促炎性細胞因子IL-1β、IL-6的產(chǎn)生，減少炎癥細胞的浸潤，改善肺組織病理變化，促進炎癥反應(yīng)與抗炎反應(yīng)的再平衡，從而從多個方面對急性肺損傷的發(fā)生、發(fā)展起抑制作用。上述研究結(jié)果提示，DHA具有治療急性肺損傷的潛在價值，并為其治療提供新的理論依據(jù)。

圖3 DHA對急性肺損傷小鼠BALF中細胞因子濃度的影響Figure 3 Effect of DHA on concentrations of cytokines in BALF of LPS-induced acute lung injury mice

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