產(chǎn)氣腸桿菌持續(xù)高產(chǎn)型AmpCβ-內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生與抗菌藥物應(yīng)用關(guān)系的研究

趙付菊， 方 毅， 張景皓， 劉文健， 周麗芳， 龐立峰， 趙 虎

(復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海200040)

染色體編碼產(chǎn)生AmpCβ-內(nèi)酰胺酶(簡(jiǎn)稱AmpC酶)的某些菌株，在β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物作用后通過引發(fā)或篩選去阻遏突變株的方式發(fā)生AmpC酶的高表達(dá)，引起臨床抗感染治療的失敗，甚至出現(xiàn)體外藥物敏感性試驗(yàn)敏感而臨床抗感染治療無效的現(xiàn)象，增大了臨床抗感染治療的難度［1］。產(chǎn)酶菌株易在長(zhǎng)期住院或接受侵入性診療及老年病患者和醫(yī)療器械中形成定植，導(dǎo)致不同程度的醫(yī)院內(nèi)傳播和流行［2］。我們前期對(duì)華東醫(yī)院臨床常見革蘭陰性桿菌產(chǎn)AmpC酶情況調(diào)查分析顯示，以銅綠假單胞菌和產(chǎn)氣腸桿菌的持續(xù)高產(chǎn)型AmpC酶菌株分離率最高，其次為陰溝腸桿菌和鮑曼不動(dòng)桿菌［3］?，F(xiàn)為進(jìn)一步探索抗菌藥物使用種類和劑量與菌株持續(xù)高產(chǎn)型AmpC酶的相關(guān)性，了解其它可能相關(guān)的臨床危險(xiǎn)因素，本研究選擇華東醫(yī)院持續(xù)高產(chǎn)型AmpC酶陽(yáng)性率最高的產(chǎn)氣腸桿菌感染的病例為研究對(duì)象，進(jìn)行前瞻性和回顧性分析。

材料和方法

一、菌株來源及研究對(duì)象的確立

收集分離自華東醫(yī)院老年病區(qū)2011年9月至2012年3月住院患者的痰液、尿液、膽汁等標(biāo)本中耐頭孢西丁的產(chǎn)氣腸桿菌19株。選擇感染產(chǎn)野生型和持續(xù)高產(chǎn)型AmpC酶的產(chǎn)氣腸桿菌的臨床病例為研究對(duì)象，對(duì)感染產(chǎn)野生型AmpC酶的產(chǎn)氣腸桿菌的臨床病例進(jìn)行前瞻性研究，對(duì)感染產(chǎn)持續(xù)高產(chǎn)型AmpC酶的產(chǎn)氣腸桿菌的臨床病例進(jìn)行回顧性調(diào)查。

二、細(xì)菌培養(yǎng)鑒定和藥物敏感性分析

根據(jù)《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》(第3版)，按常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)、分離。采用 Vitek2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)(法國(guó)生物梅里埃公司)對(duì)所分離的菌株進(jìn)行鑒定。血瓊脂、中國(guó)藍(lán)和水解酪蛋白胨平板為上?？片敿挝⑸锛夹g(shù)有限公司產(chǎn)品，藥物敏感性紙片購(gòu)自英國(guó)Oxiod公司。質(zhì)控菌株:大腸埃希菌(ATCC 25922，上海市臨床檢驗(yàn)中心)、肺炎克雷伯菌(ATCC 700603，南京便診生物科技有限公司)、陰溝腸桿菌029和陰溝腸桿菌029M(由華山醫(yī)院蔣曉飛教授惠贈(zèng))。

對(duì)感染產(chǎn)野生型AmpC酶的產(chǎn)氣腸桿菌的臨床病例持續(xù)收集其臨床標(biāo)本，分離培養(yǎng)細(xì)菌并進(jìn)行體外藥物敏感性試驗(yàn)。若再次分離出產(chǎn)氣腸桿菌，并發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)酶類型發(fā)生變化(由野生型轉(zhuǎn)變?yōu)槌掷m(xù)高產(chǎn)型)，則分析前后2株細(xì)菌的同源性。

三、改良三維試驗(yàn)分析產(chǎn)酶類型

參考胡付品等［4］報(bào)道，采用反復(fù)凍融法制備粗提酶，經(jīng)0.22μm的無菌濾膜過濾除菌后－20℃保存，陰溝腸桿菌029M和029分別作為AmpC酶陽(yáng)性和陰性對(duì)照，肺炎克雷伯菌(ATCC 700603)作為超廣譜 β-內(nèi)酰胺酶(extended spectrum beta-lactamase，ESBLs)陽(yáng)性對(duì)照。將0.5麥?zhǔn)蠁挝坏拇竽c埃希菌(ATCC 25922)涂布于水解酪蛋白胨平板上，在平板中央貼一張頭孢曲松紙片，從距離紙片5 mm處切4條裂隙并編號(hào)，①號(hào)加入30μL酶粗提液，②號(hào)加入30μL酶粗提液和10μL 4 mmol/L的氯唑西林溶液，③號(hào)加入30μL酶粗提液和10μL 2 mmol/L的克拉維酸溶液，④號(hào)加入30μL酶粗提液、10μL 2 mmol/L的克拉維酸溶液和10μL 4 mmol/L的氯唑西林溶液。37℃培養(yǎng)18 h，若裂隙與頭孢曲松紙片交界處出現(xiàn)矢狀的細(xì)菌生長(zhǎng)區(qū)域者判為三維試驗(yàn)陽(yáng)性，反之則為陰性;①②陽(yáng)性而③④陰性為單產(chǎn)ESBLs，①③陽(yáng)性而②④陰性為單產(chǎn)AmpC酶，①②③陽(yáng)性而④陰性為產(chǎn)ESBLs+AmpC酶菌株，即SSBLs菌株，①②③④全部陽(yáng)性為產(chǎn)其他水解酶，全部陰性為不產(chǎn)酶菌株。

四、脈沖場(chǎng)凝膠電泳(pulsed-field gel electrophoresis，PFGE)分析菌株同源性

布倫鄧祿普沙門菌H9812(上海市疾病預(yù)防控制中心提供)為標(biāo)準(zhǔn)菌株。配制細(xì)胞懸浮液(100 mmol/L Tris:100 mmol/L乙二胺四乙酸，pH值8.0)，用滅菌棉簽挑取平板上分離自同一患者不同時(shí)期且產(chǎn)酶類型發(fā)生變化的2株產(chǎn)氣腸桿菌，制成均勻的細(xì)菌懸液，調(diào)整濃度至4麥?zhǔn)蠁挝弧Ｈ?00μL細(xì)菌懸液和10μL 20 mg/mL蛋白酶K混合，取50℃水浴中的1%Seaken Gold瓊脂糖凝膠200μL混勻制成膠塊。膠塊凝固后將其置于 5 mL的細(xì)胞裂解液 CLB與25μL 20 mg/mL蛋白酶K混合液中，50℃輕振蕩3 h。用水洗膠2次，用Tris-乙二胺四乙酸緩沖液洗4次。最后將膠塊置5 mL Tris-乙二胺四乙酸緩沖液中，4℃保存。切2 mm寬的膠塊置于含30μL ApaⅠ酶的酶切緩沖體系中，37℃酶切3 h。配制1%Seaken Gold瓊脂糖凝膠160 mL，置于54℃的水浴中，將酶切后的膠塊按序排列在樣品梳對(duì)應(yīng)位置，將瓊脂糖緩慢倒入模具中，凝固后，拔出樣品梳，將膠塊置入電泳槽中。電泳條件:電壓6 V/cm，電泳時(shí)間 16 h，脈沖參數(shù) 0.22～18 S，120°，電泳溫度14℃。電泳結(jié)束后，Gelred染色，用熒光成像儀讀膠分析。

五、資料收集

主要病例資料收集包括患者年齡，基礎(chǔ)疾病，標(biāo)本來源，感染菌株前30 d抗菌藥物使用的種類、劑量及療程，體外藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果和改良三維試驗(yàn)結(jié)果。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

運(yùn)用WHONET 5軟件和SPSS16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、持續(xù)高產(chǎn)型AmpC酶產(chǎn)酶率和產(chǎn)酶類型分布

收集產(chǎn)氣腸桿菌19株，6株單產(chǎn)持續(xù)高產(chǎn)型AmpC酶，陽(yáng)性率為31.58%;野生型AmpC酶5株，陽(yáng)性率為26.32%;3株為SSBLs，陽(yáng)性率為15.79%;5株為產(chǎn)其他水解酶，占26.32%。選擇單產(chǎn)持續(xù)高產(chǎn)型AmpC酶菌株和產(chǎn)野生型AmpC酶菌株共11株為目的菌株，11株菌中包括同一患者來源但不同時(shí)期分離的2株產(chǎn)氣腸桿菌，1株為產(chǎn)野生型AmpC酶菌株，另1株為單產(chǎn)持續(xù)高產(chǎn)型AmpC酶菌株。

二、感染患者的臨床特點(diǎn)

10例患者分布在普外科2例，綜合內(nèi)科2例，腎內(nèi)科2例，及其他4個(gè)病區(qū)各1例;主要為高齡患者，平均年齡為84歲，9例患有3種及3種以上基礎(chǔ)疾病;檢出標(biāo)本以痰標(biāo)本為主，共6例，尿標(biāo)本3例，膽汁和膿液標(biāo)本各1例，痰和尿標(biāo)本產(chǎn)酶類型分布見表1。

表1 痰和尿標(biāo)本產(chǎn)酶類型分布 ［例(%)］

三、菌株同源性鑒定

運(yùn)用PFGE分析2株來源同一患者不同時(shí)期的產(chǎn)酶類型不同的產(chǎn)氣腸桿菌的同源性，結(jié)果顯示同源性一致，見圖1。

圖1 產(chǎn)氣腸桿菌PFGE結(jié)果的樹狀圖

四、菌株的藥物敏感性試驗(yàn)

11株產(chǎn)氣腸桿菌，比較持續(xù)高產(chǎn)型AmpC酶組和野生型AmpC酶組藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果，其中持續(xù)高產(chǎn)型AmpC酶組對(duì)頭孢他啶和頭孢呋辛的敏感性明顯低于野生型AmpC酶組，其他無明顯差異。見表2。

表2 11株持續(xù)高產(chǎn)型和野生型AmpC酶產(chǎn)氣腸桿菌藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

續(xù)表1

五、抗菌藥物應(yīng)用

10例患者中，有1例患者不同時(shí)期分離出產(chǎn)酶類型不同的2株產(chǎn)氣腸桿菌，初次分離為野生型，15 d后其產(chǎn)酶類型轉(zhuǎn)變?yōu)槌掷m(xù)高產(chǎn)型，這期間患者具體用藥:替考拉寧2.0 g/次，2次/d，共用13 d;頭孢米諾鈉2.0 g/次，2 次/d，共用 13 d。另外9例患者感染前30 d抗菌藥物使用情況:5例感染產(chǎn)持續(xù)高產(chǎn)型AmpC酶菌株患者中，2例未曾使用任何抗菌藥物，4例感染產(chǎn)野生型AmpC酶菌株患者中有1例未曾使用任何抗菌藥物。其他6例患者藥物使用情況見表3。

表3 患者感染持續(xù)高產(chǎn)型和野生型AmpC酶產(chǎn)氣腸桿菌前30 d內(nèi)抗菌藥物使用情況

討 論

AmpC酶是一種絲氨酸活性蛋白酶，Ambler分子結(jié)構(gòu)學(xué)分類屬C類，Bush-Jacoby-Medeiros功能學(xué)分類屬于1組［5］，主要由染色體介導(dǎo)，部分由質(zhì)粒介導(dǎo)，能水解大部分β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物如廣譜青霉素、頭霉素及頭孢菌素等，且不易被β-內(nèi)酰胺酶抑制劑如克拉維酸及舒巴坦所抑制。染色體介導(dǎo)表達(dá)AmpC酶的細(xì)菌主要是腸桿菌科細(xì)菌，如陰溝腸桿菌、弗氏檸檬酸桿菌、黏質(zhì)沙雷菌、產(chǎn)氣腸桿菌、普羅威登斯菌等，其他非腸道來源的革蘭陰性菌如銅綠假單胞菌、鮑曼不動(dòng)桿菌也有表達(dá)。正常情況下，AmpC酶表達(dá)呈低水平，當(dāng)β-內(nèi)酰胺抗菌藥物作用后可能引起AmpC酶表達(dá)水平提高，部分可在抗菌藥物因素去除后酶表達(dá)恢復(fù)正常，部分因去阻遏突變則引起AmpC酶持續(xù)高表達(dá)，成為產(chǎn)持續(xù)高產(chǎn)型AmpC酶菌株。

本研究中，19株產(chǎn)氣腸桿菌單產(chǎn)持續(xù)高產(chǎn)型AmpC酶陽(yáng)性率為31.58%，明顯高于國(guó)內(nèi)林奇龍等報(bào)道［6］，因菌株分離自不同病區(qū)，產(chǎn)酶菌株引起醫(yī)院交叉感染的可能性較小，故華東醫(yī)院老年病房持續(xù)高產(chǎn)型AmpC酶產(chǎn)酶率高并非交叉感染所致。標(biāo)本來源以痰標(biāo)本和尿標(biāo)本為主，痰標(biāo)本分離的持續(xù)高產(chǎn)型AmpC酶菌株占83.33%，尿標(biāo)本來源的占33.33%，提示持續(xù)高產(chǎn)型菌株分離率可能與感染部位有關(guān)［1］;藥物敏感性結(jié)果顯示，持續(xù)高產(chǎn)型組菌株對(duì)第3代以下頭孢菌素耐藥率顯著高于野生型菌株;感染病例均為高齡且多患3種以上基礎(chǔ)疾病的患者，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，第3代頭孢菌素在治療腸桿菌科細(xì)菌引起的菌血癥和腦膜炎時(shí)，即使藥物敏感性試驗(yàn)為敏感，臨床治療仍然無效［7］，提示臨床治療高齡患者呼吸道來源的產(chǎn)氣腸桿菌時(shí)慎用或避免使用第3代以下的頭孢菌素及頭霉素類抗菌藥物。

β-內(nèi)酰胺類藥物可引發(fā)持續(xù)高產(chǎn)型AmpC酶的表達(dá)，不同的β-內(nèi)酰胺類藥物的引發(fā)能力也有所差異，青霉素、阿莫西林和頭孢菌素類藥物如頭孢唑啉是AmpC酶表達(dá)的強(qiáng)引發(fā)劑，頭孢西丁和亞胺培南對(duì)AmpC酶的表達(dá)也有很強(qiáng)的引發(fā)作用［8］。本研究中，對(duì)比2組抗菌藥物的使用情況，持續(xù)高產(chǎn)型組單藥治療劑量和天數(shù)明顯高于野生型組。前瞻性研究同一來源不同時(shí)期產(chǎn)酶類型發(fā)生轉(zhuǎn)變的2株菌用藥情況，患者聯(lián)合使用糖肽類及頭霉素藥物13 d后產(chǎn)酶類型發(fā)生改變，結(jié)合持續(xù)高產(chǎn)型組與野生型組單用頭霉素藥物劑量，提示治療產(chǎn)氣腸桿菌感染時(shí)頭霉素類藥物使用2周以上易引發(fā)持續(xù)高產(chǎn)型AmpC酶菌株產(chǎn)生。單用美羅培南治療或頭孢他啶治療應(yīng)注意療程，避免細(xì)菌耐藥酶的產(chǎn)生。目前細(xì)菌耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重，喹諾酮類和碳青霉烯類藥物存在篩選出多重耐藥菌的可能，治療產(chǎn)氣腸桿菌等腸桿菌科細(xì)菌感染推薦使用哌拉西林-他唑巴坦［1］。另外，持續(xù)高產(chǎn)型組中有2例未曾使用任何藥物，考慮可能為質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC酶持續(xù)高產(chǎn)引發(fā)細(xì)菌耐藥。

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