商洛杜仲葉綠原酸含量測(cè)定及提取工藝研究

莊肅凱

（商洛學(xué)院 化學(xué)工程與現(xiàn)代材料學(xué)院/陜西省尾礦資源綜合利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西商洛 726000）

杜仲(Eucommia ulmoides Oliv.)，落葉喬木，是我國(guó)特有的樹(shù)種和傳統(tǒng)的名貴中藥材[1]，其作為中藥材的歷史可以追溯到兩千年以上[2]。傳統(tǒng)藥方中，杜仲以皮入藥。剝皮需要較長(zhǎng)的生長(zhǎng)樹(shù)齡，且技術(shù)要求較高，剝皮不當(dāng)會(huì)造成樹(shù)干干枯老化甚至死亡，大大降低了經(jīng)濟(jì)效益和生態(tài)效益。研究表明，杜仲葉與杜仲皮具有相似的化學(xué)成分和藥理作用[3]，以杜仲葉為原料的相關(guān)產(chǎn)品越來(lái)越多[4-5]。綠原酸是杜仲中主要活性成分之一，有著多樣的生物活性，如抗菌[6]、抗病毒[7]、降血壓[8]、降血脂[9]、增強(qiáng)免疫功能[10-11]等，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥[12-13]、食品[14-15]、化妝品[16]等領(lǐng)域。因此，以杜仲葉為原料提取綠原酸，社會(huì)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)前景良好。本研究以商洛市杜仲葉為原料，采用單因素試驗(yàn)，對(duì)提取杜仲葉中綠原酸的條件進(jìn)行探索。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)正交試驗(yàn)以期得到利用杜仲葉提取綠原酸的最佳工藝條件，旨在為商洛市杜仲資源的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

儀器：UV757CRT紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) (上海海曙精密科學(xué)儀器有限公司)；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；DHG-9070A電熱恒溫干燥箱(上海齊欣科學(xué)儀器有限公司)；電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)。

原料：杜仲葉，2013年5月采自陜西省丹鳳縣龍駒寨鎮(zhèn)。杜仲葉采集后，50℃下干燥，粉碎，密封保存?zhèn)溆谩?/p>

試劑：綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品（西安飛達(dá)生物科技有限公司，HPLC純度>98%）；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

精密稱(chēng)取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品2.0 mg，無(wú)水乙醇溶解并定容于100 mL容量瓶中得濃度為20.0 μg·mL－1的綠原酸標(biāo)準(zhǔn)液。量取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)液1.00，2.00，3.00，4.00，5.00，6.00，7.00，8.00，9.00，10.00 mL分別置于10 mL比色管中，用無(wú)水乙醇稀釋至刻度，搖勻，分別得到濃度為 2.0，4.0，6.0，8.0，10.0，12.0，14.0，16.0，18.0 μg·mL－1和 20.0 μg·mL－1的系列溶液，測(cè)量溶液在330 nm處的吸光度。以綠原酸濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)作圖，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，如圖1。

圖1 綠原酸吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

回歸方程為：y=0.0421x+0.0932，R2=0.9957。說(shuō)明綠原酸在 2.0-20.0 μg·mL－1濃度范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。

由回歸方程得綠原酸含量計(jì)算公式：

Y=(y-0.0932)/0.0421×V×N×10-6/M×100%

式中Y為杜仲葉中綠原酸的提取率(%)；y為吸光度；V為提取液的體積 (mL)；N為稀釋倍數(shù)；M為杜仲葉原料的質(zhì)量(g)。

2.2 單因素試驗(yàn)

精密稱(chēng)取杜仲葉1.00 g，加入提取溶劑，在不同因素條件下浸提。浸提完畢后，冷卻至室溫，收集浸提液，過(guò)濾，濾液濃縮定容至50 mL。量取1.00 mL定容液，稀釋至10 mL，測(cè)定330 nm波長(zhǎng)處吸光度。依次改變浸提溶劑的濃度、提取溫度、提取時(shí)間及料液比，分別研究各提取條件對(duì)杜仲葉中綠原酸提取率的影響。

2.2.1 乙醇濃度對(duì)綠原酸提取率的影響

設(shè)置提取時(shí)間2 h，提取溫度50℃，料液比1:20，分別研究乙醇濃度為 40%，50%，60%、70%、80%條件下杜仲葉中綠原酸提取率，結(jié)果如圖2。

圖2 乙醇濃度對(duì)綠原酸提取率的影響

結(jié)果表明，隨著乙醇濃度的升高，綠原酸提取率逐漸上升，當(dāng)乙醇濃度為60%時(shí)，提取率達(dá)到最大值，繼續(xù)升高乙醇濃度，提取率反而下降。其原因可能是高濃度的乙醇會(huì)使一些大分子物質(zhì)和綠原酸產(chǎn)生共沉淀現(xiàn)象，造成綠原酸的損失。因此，確定乙醇濃度為60%。

2.2.2 提取時(shí)間對(duì)綠原酸提取率的影響

以60%乙醇為提取溶劑，設(shè)置提取溫度50℃，料液比 1:20，分別研究 1，1.5，2，2.5，3h 條件下杜仲葉中綠原酸提取率，結(jié)果如圖3。

圖3 提取時(shí)間對(duì)綠原酸提取率的影響

結(jié)果表明，時(shí)間從1-2.5 h，綠原酸的提取率隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)而提高。當(dāng)時(shí)間為2.5 h時(shí)，提取率達(dá)到最大值。繼續(xù)延長(zhǎng)時(shí)間，提取率變化不大，甚至稍有下降。因此，確定提取的最佳時(shí)間為2.5 h。

2.2.3 溫度對(duì)綠原酸提取率的影響

以60%乙醇為提取溶劑，設(shè)置提取時(shí)間2.5 h，料液比 1:20，分別研究 50℃，60℃，70℃，80℃，90℃條件下杜仲葉綠原酸提取率，結(jié)果如圖4。

圖4 溫度對(duì)綠原酸提取率的影響

結(jié)果表明，隨著溫度的升高，綠原酸的提取率越來(lái)越高。但當(dāng)溫度超過(guò)80℃后，提取率變化不大，甚至稍有下降?？赡茌^高溫度會(huì)引起綠原酸分解。因此，確定提取的最佳溫度為80℃。

2.2.4 料液比對(duì)綠原酸提取率的影響

設(shè)置提取時(shí)間2.5 h，溫度為80℃，分別用15.0，20.0，25.0，30.0，35.0 mL 濃度為 60%的乙醇提取1.0 g杜仲葉，綠原酸提取率結(jié)果如圖5。

結(jié)果表明，隨著溶劑體積的增加，綠原酸的提取率增大。當(dāng)料液比為1:20時(shí)，再增加溶劑體積，提取率變化不明顯，但增加了成本和后處理的難度。因此，料液比以1:20為宜。

2.3 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)影響杜仲葉中綠原酸提取效果的乙醇濃度(A)、提取時(shí)間(B)、提取溫度(C)、料液比(D)4個(gè)因素，設(shè)計(jì)4因素3水平的L9(34)正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

圖5 料液比對(duì)綠原酸提取率的影響

表1 正交試驗(yàn)因素水平

以綠原酸提取率為考核指標(biāo)，正交試驗(yàn)有關(guān)數(shù)據(jù)及結(jié)果分析見(jiàn)表2和表3。

由表3可以看出，對(duì)杜仲葉中綠原酸提取率影響的因素依次是A>D>B>C，即乙醇濃度>料液比>提取時(shí)間>提取溫度。杜仲葉中綠原酸的最佳提取工藝是A3B2C2D2，即乙醇濃度為60%，提取時(shí)間2.5 h，提取溫度70℃，料液比為1:20。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

2.4 測(cè)定結(jié)果

2.4.1 重現(xiàn)性試驗(yàn)

精密稱(chēng)取杜仲葉粉末7份，每份1.0 g，按照正交試驗(yàn)所獲得的最佳實(shí)驗(yàn)條件，平行測(cè)定，見(jiàn)表4，綠原酸平均提取率為2.114%，RSD=4.29%(n=7)。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取濃度為 20.0 μg·mL－1綠原酸溶液避光冷藏保存，在330 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，每天平行測(cè)定3次，取平均值。由表5可知，綠原酸含量在一周內(nèi)有所 下降，但下降幅度很小，可能少量綠原酸發(fā)生了分解。

表3 正交試驗(yàn)分析

表4 重現(xiàn)性測(cè)定結(jié)果

表5 穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果

2.4.3 回收率試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱(chēng)取同一批次相同質(zhì)量的杜仲葉6份，分別加入不同量的綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品，按照供試樣品溶液的制備方法制得溶液，測(cè)定吸光度并計(jì)算綠原酸含量，結(jié)果見(jiàn)表 6。

表6 回收率測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)論

通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，得到提取綠原酸的最佳工藝條件為：提取溶劑為60%的乙醇，提取時(shí)間2.5 h，提取溫度80℃，料液比為1:20。通過(guò)對(duì)正交試驗(yàn)的分析可知，杜仲葉中綠原酸提取率的影響因素由大到小為：乙醇濃度＞料液比＞提取時(shí)間＞提取溫度。

采用紫外分光光度法，測(cè)定了商洛市杜仲葉中綠原酸的含量為2.114%，平均加樣回收率為99.37%，RSD為1.70%，重現(xiàn)性好。分光光度法可作為檢測(cè)商洛杜仲葉中綠原酸含量的一種方法，為商洛市杜仲葉綠原酸的開(kāi)發(fā)利用提供參考。

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