云南省中醫(yī)藥治療艾滋病生物樣本庫(kù)的建立與管理*

宋娜麗， 楊玉琪， 趙 遠(yuǎn)， 喬金麗， 汪林芬， 張媛

(1.云南省中醫(yī)中藥研究院， 云南 昆明 650223； 2.大理學(xué)院， 云南 大理 671000)

生物樣本庫(kù)(Biobank)也稱生物信息庫(kù)或生物材料和數(shù)據(jù)庫(kù)，指的是長(zhǎng)期保存的人體材料和樣本，這些樣本可與個(gè)人數(shù)據(jù)及有關(guān)它們供者的信息相聯(lián)系或沒(méi)有聯(lián)系。人體組織的樣本包括細(xì)胞、組織和血液以及作為遺傳信息物質(zhì)的DNA。經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織(OECD)定義為：生物樣本庫(kù)是一種集中保存各種人類生物材料(Human biological material)，用于疾病的臨床治療和生命科學(xué)研究的生物應(yīng)用系統(tǒng)。云南省是我國(guó)艾滋病的高發(fā)區(qū)，感染者具有多民族、多途徑感染的特點(diǎn)，使云南省艾滋病感染者防治的研究頗具代表性。自2005年云南省中醫(yī)藥治療艾滋病試點(diǎn)項(xiàng)目開(kāi)展以來(lái)，截止2014年2月底，已累計(jì)治療感染者11806例，正在治療6791例。規(guī)范管理并長(zhǎng)期保存依從性好、治療有效的感染者標(biāo)本，為我省、乃至全國(guó)科研工作者提供有價(jià)值的樣本，是本院工作人員考慮的工作重點(diǎn)之一。本研究將以“珍惜樣本、執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)、充分應(yīng)用、維護(hù)產(chǎn)權(quán)”為原則和宗旨[1]，初步建立云南省中醫(yī)藥治療艾滋病生物樣本庫(kù)，并實(shí)施信息化管理。

1 材料與方法

1.1 材料 海爾-80℃冰箱，金鳳牌YDS-50B-125型液氮罐，貝克曼血球計(jì)數(shù)儀、生物安全柜、超凈工作臺(tái)、離心機(jī)、德國(guó)產(chǎn)2 mL凍存管，凍存管盒、淋巴細(xì)胞分離液、胎牛血清、DMSO、PBS、抗凝、促凝采血管，采血針等。

1.2 標(biāo)本的采集、分裝

1.2.1 全血：按照血液采集標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(下同)，取2 mL抗凝全血直接分裝于凍存管，1管/人。置入-20℃冰箱，過(guò)夜轉(zhuǎn)入-80℃。

1.2.2 血清、血漿、白細(xì)胞、紅細(xì)胞 分別取促凝管和抗凝管采4～6 mL全血，2200 rpm/min水平離心10 min，無(wú)菌移液器分別吸出血清、血漿、抗凝管中間白細(xì)胞層以及下層紅細(xì)胞，分別裝入凍存管中，1.5 mL/管，1～2管/人。

1.2.3 外周血單核細(xì)胞(PBMC) 離心后的抗凝全血，取血漿保存后，將剩余血細(xì)胞用PBS緩沖液按1：1等倍稀釋，輕吹使其充分混勻后，緩緩加入有淋巴細(xì)胞分離液的離心管。加入時(shí)離心管傾斜45度角，用軟吸管先浸潤(rùn)離心管壁，在距分離液上方1 cm處，使稀釋液重疊于分層液之上(加入時(shí)勿破壞液面，并保持兩界面清晰，勿沖破淋巴細(xì)胞分離液界面)，水平離心機(jī)2200 rpm/min離心20 min，用無(wú)菌吸管吸取白細(xì)胞層，置另一15 mL離心管中，重復(fù)洗3次。血球計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)細(xì)胞，加細(xì)胞凍存液保存于凍存管。

1.3 樣本保存 所有保存樣本依據(jù)編號(hào)規(guī)則確定唯一編號(hào)后，放入凍存盒置-20℃冰箱過(guò)夜，再轉(zhuǎn)入-80℃，整理后放液氮罐長(zhǎng)期保存。PBMC最好采用程序性降溫盒降溫后置液氮罐保存，可大大提高細(xì)胞凍存的存活率。

2 結(jié)果

本研究已收集中醫(yī)藥治療1年以上且有效的艾滋病血液標(biāo)本共50余例，近300份，并收集血液樣本捐贈(zèng)者基本信息及歷次生化、血常規(guī)、CD4和病毒載量等檢測(cè)結(jié)果，可用于云南省中醫(yī)藥治療艾滋病藥物作用靶點(diǎn)等相關(guān)研究，熟悉云南省中醫(yī)藥治療艾滋病血液樣本庫(kù)的建立與信息化管理，自血液樣本庫(kù)建立以來(lái)，各環(huán)節(jié)正常運(yùn)行。

3 知情同意

知情同意[2～3]是建立血液樣本庫(kù)過(guò)程中遇到的最重要的法律和倫理學(xué)問(wèn)題，它是保證受試者或者血液捐贈(zèng)者了解并理解試驗(yàn)或研究的目的和內(nèi)容，自愿同意參加試驗(yàn)或研究、有權(quán)知道研究結(jié)果、并有權(quán)隨時(shí)放棄參加研究的一種書(shū)面同意書(shū)。這也是對(duì)所有進(jìn)行人體研究或人體取樣調(diào)查的研究人員的倫理學(xué)要求。在以人為試驗(yàn)或研究對(duì)象的領(lǐng)域，研究人員必須獲得知情同意，使受試者或者血液捐贈(zèng)者的利益和權(quán)利得到保護(hù)，同時(shí)，這也是對(duì)研究人員的保護(hù)。

本項(xiàng)研究方案已通過(guò)相關(guān)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的審查和批準(zhǔn)，在知情同意書(shū)中分析了血樣捐贈(zèng)者的風(fēng)險(xiǎn)和不適，明確了權(quán)利、職責(zé)和隱私保護(hù)問(wèn)題。

4 質(zhì)量控制

質(zhì)量控制[4]是建立艾滋病血液樣本庫(kù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。給其他科研課題提供有質(zhì)量保證的樣本是減少物資、人力浪費(fèi)和避免重復(fù)研究的重要途徑。為保證血液樣本質(zhì)量應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：1.制定并嚴(yán)格遵守質(zhì)量控制體系文件。2.從血樣采集、分裝、運(yùn)輸?shù)奖４娴雀鱾€(gè)環(huán)節(jié)，都應(yīng)嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程操作。3.盡量縮短從血樣采集到保存的時(shí)間，血樣分裝應(yīng)在生物安全柜進(jìn)行，PBMC的分離操作嚴(yán)格按照無(wú)菌操作條件進(jìn)行。4.嚴(yán)密監(jiān)控冰箱、液氮罐等凍存容器的工作狀況，確保正常運(yùn)行。5.標(biāo)本的使用應(yīng)合理、謹(jǐn)慎，在物盡其用的前提下，減少反復(fù)凍融次數(shù)，避免血樣浪費(fèi)。

5 信息化管理[5]

建立并使用凍存標(biāo)本管理系統(tǒng)，可有效長(zhǎng)期、大量保存血液標(biāo)本，信息化管理有以下特點(diǎn)：1.可添加多級(jí)目錄，便于對(duì)凍存罐所屬的小組或部門(mén)進(jìn)行更好管理。2.可形象而生動(dòng)的表示凍存管位置和當(dāng)前凍存情況，令管理者和凍存人員對(duì)當(dāng)前凍存狀況一目了然。3.可為每管樣本或細(xì)胞添加多張圖片，實(shí)現(xiàn)真正的圖文管理。4.既可以圖文方式打印單管樣本記錄，也可通過(guò)查找功能導(dǎo)出自己所需要的細(xì)胞凍存記錄，并導(dǎo)出至Excel文件中，方便統(tǒng)計(jì)、總結(jié)等工作。5.具備查找功能?？砂凑詹檎曳秶⒓?xì)胞名稱、凍存日期、復(fù)蘇日期、凍存者、復(fù)蘇者、備注等條件進(jìn)行查找，同時(shí)也可以選擇導(dǎo)出至Excel文件。

6 生物安全[6]

6.1 管理體系 根據(jù)國(guó)務(wù)院《病原微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全管理?xiàng)l例》的規(guī)定和《實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求》(GB19489-2008)的要求，在省衛(wèi)生廳的領(lǐng)導(dǎo)和支持下，成立了由單位法人為第一負(fù)責(zé)人的生物安全管理領(lǐng)導(dǎo)小組。單位血液樣本庫(kù)團(tuán)隊(duì)由實(shí)驗(yàn)室分管領(lǐng)導(dǎo)、實(shí)驗(yàn)室業(yè)務(wù)骨干、檢驗(yàn)技術(shù)人員、中醫(yī)藥治療艾滋病研究人員和護(hù)理人員組成，經(jīng)過(guò)專業(yè)培訓(xùn)和學(xué)習(xí)，從事相關(guān)業(yè)務(wù)工作4年以上，具有較強(qiáng)的生物安全意識(shí)。

6.2 管理制度

6.2.1 為確保生物安全，制定了嚴(yán)格的管理制度，包括適用于本單位的《實(shí)驗(yàn)室生物安全管理手冊(cè)》和一系列的實(shí)驗(yàn)室生物安全體系文件。

6.2.2 因本單位承擔(dān)著云南省中醫(yī)藥治療艾滋病的部分患者血液檢測(cè)工作，故艾滋病血液樣本庫(kù)區(qū)采取出入庫(kù)血液樣本交接、審核、登記制度和雙人雙鎖的保管制度，嚴(yán)把庫(kù)區(qū)門(mén)戶安全。

6.2.3 對(duì)入庫(kù)標(biāo)本進(jìn)行嚴(yán)格的登記和到期銷毀制度。詳細(xì)登記血液樣本捐贈(zèng)者信息：姓名、性別、出生日期、采集日期、采集單位等，明確標(biāo)記樣本類型信息：全血(BB)、血清(BS)、血漿(BP)、白細(xì)胞(BW)、紅細(xì)胞(BE)、外周血單核細(xì)胞(PBMC)以及樣本量和編號(hào)。樣本交接單應(yīng)注明樣本運(yùn)輸過(guò)程中異常狀況等。

6.3 預(yù)防措施 已經(jīng)向上級(jí)主管部門(mén)遞交《云南省病原微生物實(shí)驗(yàn)室備案登記表》，成立實(shí)驗(yàn)室突發(fā)事件應(yīng)急預(yù)案管理程序，防止樣本丟失、暴力恐怖及自然災(zāi)害等因素危及實(shí)驗(yàn)室和血液樣本的生物安全。

7 討論

目前，大多學(xué)者認(rèn)為生物樣本庫(kù)對(duì)于促進(jìn)醫(yī)學(xué)研究、醫(yī)學(xué)人文、探究疾病的本質(zhì)及演變規(guī)律、更好的預(yù)防和治療疾病有著重要意義。國(guó)內(nèi)外生物樣本庫(kù)已逐漸向標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化、專業(yè)化、特色化、信息化、國(guó)際化、職能化方向發(fā)展，美國(guó)和歐洲的樣本庫(kù)起步較早，成立了專業(yè)性、非營(yíng)利性的組織庫(kù)協(xié)會(huì)，并制定相應(yīng)的協(xié)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)考核合格并取得能力認(rèn)證證書(shū)的人員才能參與組織庫(kù)的工作。隨著基因組學(xué)和蛋白組學(xué)的發(fā)展和人們對(duì)生物醫(yī)學(xué)資源認(rèn)識(shí)的提高，國(guó)內(nèi)外已形成了腫瘤庫(kù)、骨庫(kù)、眼庫(kù)、胚胎庫(kù)、干細(xì)胞庫(kù)等專業(yè)化的樣本庫(kù)，國(guó)內(nèi)醫(yī)療機(jī)構(gòu)雖然在腫瘤庫(kù)等方面和國(guó)外合作，建立了自己的樣本庫(kù)，但因客觀和意識(shí)的差距，仍不夠完善。提高醫(yī)療機(jī)構(gòu)和科研人員利用生物醫(yī)學(xué)資源的意識(shí)是關(guān)鍵，對(duì)于有特定研究?jī)r(jià)值的血液、組織、器官及相關(guān)醫(yī)學(xué)信息都是樣本庫(kù)收集范圍，只要有低溫存儲(chǔ)設(shè)備和廠房，許多醫(yī)療機(jī)構(gòu)都可以組建有地區(qū)特色、有病種特色的樣本庫(kù)，為地方病的防治和我國(guó)原創(chuàng)藥物的研發(fā)創(chuàng)建良好的平臺(tái)[6]。

自從2005年云南省中醫(yī)中藥研究院開(kāi)展中醫(yī)藥治療艾滋病試點(diǎn)項(xiàng)目以來(lái)，對(duì)艾滋病血液樣本的采集、保存和處理一直依據(jù)生物安全等要求采取謹(jǐn)慎的態(tài)度，但未建立起規(guī)范的科研型血液樣本庫(kù)，未采取有效的長(zhǎng)期保存樣本的方法，致使科研人員不能對(duì)長(zhǎng)期治療患者進(jìn)行縱向追溯研究，許多有價(jià)值的樣本無(wú)法充分利用，浪費(fèi)了大量樣本資源?？茖W(xué)、規(guī)范管理云南省中醫(yī)藥治療艾滋病血液樣本，將為艾滋病的基礎(chǔ)和臨床研究提供寶貴的實(shí)物資源和病例信息共享資源，為探索中醫(yī)藥有效治療艾滋病的作用靶點(diǎn)和作用規(guī)律、實(shí)現(xiàn)樣本最大限度的開(kāi)發(fā)利用提供良好的平臺(tái)，也將一定程度的實(shí)現(xiàn)陳賽娟院士所說(shuō)的將試點(diǎn)項(xiàng)目檢測(cè)后的血液樣本“變廢土為黃金”[2]，以后筆者會(huì)繼續(xù)完善中醫(yī)藥治療艾滋病樣本庫(kù)，將DNA、RNA提取物及病理組織等納入收集范圍[7]，為云南省中醫(yī)藥治療艾滋病的研究、醫(yī)療技術(shù)、生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展起到促進(jìn)作用。

參考文獻(xiàn)：

[1]張小燕.中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會(huì)組織生物樣本庫(kù)分會(huì)成立大會(huì)會(huì)議紀(jì)要，中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù)，2010，5(1)：76.

[2]劉閔，翟曉梅，邱仁宗.生物信息庫(kù)的知情同意問(wèn)題[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)倫理學(xué)，2009，22(2)：31-33.

[3]S.G.Shirley，C.H.P.Durst，C.C.Fuchs，et al.A large-scale cryoelectronic system for biological sample banking[J].cryogenics，2009，49：638-642.

[4]趙娟，李鋒，李思源，等.生物樣本庫(kù)的建立與管理[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2010，10(5)：999-1000.

[5]叢憲玲，孫然，王涵，等.國(guó)內(nèi)外組織標(biāo)本庫(kù)發(fā)展的現(xiàn)狀及啟示[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2010，14(1)：148-150.

[6]林暉，林長(zhǎng)纓，劉醫(yī)萌，等.科學(xué)管理傳染病生物樣本庫(kù)確保生物安全[J].首都公共衛(wèi)生，2010，(4)3：140-141.

[7]萬(wàn)美容，劉福民，劉小云.腫瘤組織庫(kù)的建立與管理[J].徐州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，29(2)：104-105.