“逆流-超聲-熱壓”技術(shù)在刺五加葉中提取黃酮類化合物的應(yīng)用

王海蓉 趙 靜 趙傳玉

（1.哈爾濱申宜科技有限公司，黑龍江 哈爾濱 150090；2.黑龍江省計(jì)算中心，150028）

刺五加為五加科植物，又名五加參，其根、莖、葉均可作為藥用，是東北地區(qū)典型的藥用植物，味辛、微苦，無毒。具有益氣健脾、益精壯骨、補(bǔ)腎安神之功效。其中的黃酮類化合物更是具有廣泛的藥理活性，它存在于刺五加的各部位，屬葉中含量最高。

隨著時(shí)代的進(jìn)步和科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，提取刺五加中黃酮類化合物的提取方法也日益廣泛應(yīng)用于黃酮類化合物的提取中，如微波法、超聲法、超臨界流體萃取法等。傳統(tǒng)提取法都有共同的缺點(diǎn)就是提取時(shí)間長，溶劑用量大，提取率不高等?，F(xiàn)代提取法超臨界流體萃取法雖選擇性強(qiáng)、提取物純度高，但由于其操作壓力高、能量消耗大、自身成本較高，因而不能進(jìn)行工業(yè)生產(chǎn)。

我們自行研制的“逆流-超聲-熱壓”聯(lián)用提取技術(shù)是基于連續(xù)逆流提取技術(shù)和超聲強(qiáng)化提取技術(shù)的融合與改進(jìn)。在逆流提取過程中，間歇地對被浸提的植物原料進(jìn)行機(jī)械擠壓及局部加熱，植物原料在機(jī)械壓力和局部升溫的雙重作用下，在極短的時(shí)間內(nèi)完成一次徹底的傳質(zhì)交換過程。該技術(shù)為我單位最新研發(fā)成功的專有技術(shù)，目前已經(jīng)完成樣機(jī)測試檢驗(yàn)，具有工作能耗低、溶媒用量少、提取率高、可低溫高效浸提等多方面優(yōu)勢特點(diǎn)。

1.材料與方法

1.1 材料與儀器

刺五加葉，采自黑龍江省七臺(tái)河市金沙農(nóng)場。槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品，中國藥品生物制品檢定所；實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純試劑，北京化工試劑廠；實(shí)驗(yàn)用水由蒸餾水經(jīng)純化器純化所得。

自主研發(fā)的“逆流-超聲-熱壓”聯(lián)用提取設(shè)備；BS-124，電子天平，Sartorius AG，德國；紫外可見分光光度計(jì)，上海分析儀器公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海；TDL-5-A低速大容量離心機(jī)，上海安寧科學(xué)儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原料預(yù)處理

將新鮮的黑龍江省刺五加葉洗凈、曬干、粉碎，放在干燥器中備用。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)品的制備

精確稱取槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品2.00mg，加60%的乙醇定容至50 mL容量瓶中，得到0.2 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。5 % NaNO2吸光度（A）為縱坐標(biāo)，對照品濃度（C）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

為進(jìn)一步優(yōu)化“逆流-超聲-熱壓”聯(lián)用提取技術(shù)提取刺五加葉中黃酮類化合物的實(shí)驗(yàn)條件，以溶劑濃度，提取時(shí)間、提取次數(shù)和料液比作為提取因素，按照L9（3）4進(jìn)行提取，如表1所示。溶液：稱取5g分析純NaNO2，用蒸餾水溶解后定容至100 mL；10 % Al（NO3）3溶液：稱取10g 分析純Al（NO3）3用蒸餾水定容至100 mL；4 % NaOH溶液：稱取4 g分析純NaOH，用蒸餾水溶解后定容至100 mL。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

1.2.3 “逆流-超聲-熱壓”聯(lián)用提取法

由于該實(shí)驗(yàn)使用的是企業(yè)中試型設(shè)備，所以，刺五加葉原料的使用量和溶劑的使用量較多。首先取出2.5kg用50%的工業(yè)乙醇在提取設(shè)備內(nèi)提取，提取時(shí)間為 1.5 h，料液比為20倍，將提取液合并后用石油醚處理，直至浸提液無色，使葉綠素和其它親脂性物質(zhì)完全除去。最后將提取液減壓蒸餾至干。取刺五加粉末3份，每份約2.5000±0.0002 g，用60%的乙醇分別溶解并定容在250 mL容量瓶中，冷藏備用。

1.2.4 總黃酮含量的測定

采用硝酸鋁-亞硝酸鈉法,取0.2 mL提取液于5mL的容量瓶中，加入0.2 mL 5% NaNO2溶液，搖勻，靜置6 min；分別加入0.2 mL 10% Al（NO3）3溶液，搖勻，靜置 6 min；再分別加入1.0 mL 4%NaOH 溶液，用 60%乙醇定容，搖勻，靜置 15 min，在500nm處測吸光度。以

2 結(jié)果與討論

2.1 溶劑濃度對“逆流-超聲-熱壓”聯(lián)用提取技術(shù)提取率的影響

料液比為1：20，提取時(shí)間為2h，用不同濃度的乙醇溶液為提取溶劑進(jìn)行提取2次，乙醇溶液濃度分別為30%、40%、50%、70%、80%、100%。采用分光光度法測定各提取液中總黃酮的含量。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，總黃酮的含量隨著乙醇濃度的增加而增加，當(dāng)乙醇含量為50%時(shí)，提取的總黃酮含量為53.23mg/g，總黃酮含量最高；而后雖乙醇濃度的增加，總黃酮含量減少，可見采用50%的乙醇溶液提取刺五加葉中黃酮類化合物的效果最佳。

2.2 提取時(shí)間對提取率的影響

用50%乙醇，料液比為1：20，在不同的提取時(shí)間：1h、1.5h、2h、2.5h、3h，進(jìn)行提取2次,采用分光光度法測定各提取液中總黃酮的含量。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出：隨著時(shí)間的增加，總黃酮含量相應(yīng)增加，但是提取時(shí)間2h后，增加幅度明顯減小，所以選擇提取時(shí)間為2h。

2.3 提取次數(shù)對提取率的影響

提取溶劑乙醇含量為50%，料液比為1：20，用不同的提取次數(shù)：1次、2次、3次、4次，提取2h，采用分光光度法測定各提取液中總黃酮的含量。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

表3 正交實(shí)驗(yàn)方差分析表

表4 最佳工藝條件的驗(yàn)證結(jié)果

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出，隨著提取次數(shù)的增加，總黃酮含量增加，增加幅度逐漸減慢?？紤]到經(jīng)濟(jì)實(shí)用等方面因素，選擇提取2次最為合適。

2.4 料液比對提取率的影響

提取溶劑乙醇含量為50%，提取時(shí)間 2h，在不同的料液比：1：10、1：15、1：20、1：25、1：30，提取 2 次，采用分光光度法測定各提取液中總黃酮的含量。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出，隨著溶劑用量的增加，總黃酮含量也增加。當(dāng)溶劑用量達(dá)到20倍后，刺五加液中總黃酮含量基本保持不變，所以從節(jié)約成本等多方面因素選擇溶劑用量為20倍。

2.5 正交實(shí)驗(yàn)的考察

2.5.1 結(jié)果及方差分析

以溶劑濃度、提取時(shí)間、提取次數(shù)和料液比作為四因素進(jìn)行L9（3）4正交試驗(yàn)，得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示：

正交實(shí)驗(yàn)的方差分析結(jié)構(gòu)如表3：

結(jié)合極差分析和方差分析可知，溶劑濃度、提取時(shí)間、料液比三因素對總黃酮提取量的影響主次順序?yàn)椋禾崛〈螖?shù)（C）>溶劑濃度（A）>料液比（D）＞提取時(shí)間（B）,最佳的提取條件為：A2B1C2D3，即溶劑濃度為50%，提取時(shí)間為2h，提取次數(shù)為2次，料液比為1：20。

2.5.2 最佳工藝的驗(yàn)證

在優(yōu)化組合A2B1C2D3的條件下，進(jìn)行三次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，以驗(yàn)證最優(yōu)工藝的可行性和合理性。結(jié)果如表4所示，在最優(yōu)提取工藝下，提取的總黃酮的平均含量為53.85mg/g，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.85%，該方法可行性較高。

結(jié)語

通過采用“逆流-超聲-熱壓”聯(lián)用提取技術(shù)提取刺五加葉中的黃酮類化合物，間歇地對原料進(jìn)行熱壓和釋放作用，提取效率顯著提高。因而確定最佳實(shí)驗(yàn)條件為：溶劑為50%乙醇、提取時(shí)間為2h、提取次數(shù)2次、料液比為1：20。此新設(shè)備具有耗能低、提取效率高、操作簡單、成本低廉等特點(diǎn)，為更好的開發(fā)利用刺五加葉中的黃酮類化合物提供了實(shí)驗(yàn)參考和依據(jù)。

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