再力花葉斑病病原菌鑒定

歐克芳　李旭旭

摘要：2008年以來，在武漢市再力花葉片上發(fā)現(xiàn)一種病害，該病發(fā)病初期為紅褐色針尖狀圓點，后擴展為圓形、橢圓形或不規(guī)則形，病斑中央灰白至灰褐色，斑緣紅褐色，外有黃色暈圈，病健交界明顯；發(fā)病后期病斑進一步擴展聯(lián)合成大病斑，發(fā)病嚴重的植株，多數(shù)葉片布滿病斑且干枯死亡，嚴重影響植株的光合作用和觀賞價值。從葉片上分離得到病菌，經(jīng)柯赫氏法則驗證，鑒定該病原菌為鏈格孢屬鏈格孢菌[Alternaria alternate （Fr.） Keirssler]。該病菌為害再力花引起葉斑病在國內(nèi)尚屬首次報道。

關(guān)鍵詞：再力花；葉斑??；病原鑒定；鏈格孢菌

中圖分類號： S436.8+1文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）09-0113-02

收稿日期：2013-11-20

基金項目：湖北省武漢市建委項目（編號：武建2008-92）；武漢市園林局項目（編號：武園2008-17）。

作者簡介：歐克芳（1980—），女，湖北公安人，碩士，工程師，研究方向為濕地植物病蟲害。E-mail：oukefang@163.com。再力花（Thalia dealbata）別名水竹芋，為竹芋科再力花屬多年生宿根挺水草本，原產(chǎn)于美國南部和墨西哥[1]。再力花植株高大美觀，碩大的葉片翠綠可愛，花序高出葉面，亭亭玉立；花朵素雅別致，是一種觀賞價值極高的挺水花卉。再力花除有很高的觀賞價值外，還有較好的吸附重金屬、凈化水質(zhì)的作用[2-3]，近年被新引入我國并被廣泛應用于濕地或公園水景，可配置香蒲、千屈菜、荷花等形成獨特的水體景觀，也可盆栽觀賞或種植于庭院水體景觀中。2008—2012年，在武漢市解放公園和月湖公園等再力花種植區(qū)進行調(diào)查時，發(fā)現(xiàn)再力花葉病斑發(fā)生普遍，嚴重影響其觀賞價值，目前，國內(nèi)尚未見再力花病害的研究報道。本研究對再力花葉病斑病原物進行分離、鑒定，以期明確病原菌，為該病害的防治提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1病原菌的分離與培養(yǎng)

2012年4—11月，對武漢市解放公園、月湖公園、武漢植物園及武漢市園林科學研究所水生池種植區(qū)的再力花葉斑病發(fā)生和為害情況進行調(diào)查，并對田間病株出現(xiàn)的癥狀進行描述并拍照。采集典型病葉，用常規(guī)的組織分離法分離病葉：切取發(fā)病典型的再力花葉片病健交界處5 mm×5 mm的組織，先在70%乙醇中消毒5 s，再置于0.1% HgCl2中消毒1 min，無菌水漂洗3～4次，接種到PDA培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g、葡萄糖15 g、瓊脂15 g、水1 000 mL）中，于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 3 d，挑取組織塊周圍的菌落轉(zhuǎn)皿進行純化，獲得的純菌種保存于PDA斜面，置4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2致病性測定

將病原菌接種到PDA平板上活化，25 ℃條件下12 h光照、12 h黑暗交替培養(yǎng)10 d，用無菌水洗下分生孢子，配制成1×106個/mL的孢子懸浮液，選取健康再力花葉片，分別采用直接懸滴法和針刺懸滴法接種。接種前用無菌水將再力花表面蠟粉洗凈，葉片每側(cè)接種5～6個點，每個點接種約8 μL孢子懸浮液，以滴加8 μL無菌水的葉片為對照。每組接種30張葉片，重復3次，觀察發(fā)病情況。

1.3病原菌形態(tài)觀察

1.3.1病原菌菌落觀察活化病原菌，從菌落邊緣取直徑 5 mm 病原菌菌絲塊分別置于PDA培養(yǎng)基和PCA培養(yǎng)基（馬鈴薯20 g、胡蘿卜20 g、瓊脂15 g、水1 000 mL）中，25 ℃培養(yǎng)，觀察病原菌在2種培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)、大小、色素類型。

1.3.2PCA培養(yǎng)基上病菌形態(tài)觀察將病菌接種到PCA培養(yǎng)基平板上，25 ℃條件下12 h光照、12 h黑暗交替培養(yǎng) 5 d，在顯微鏡下觀察分生孢子梗與分生孢子形態(tài)，并用目鏡測微尺測量分生孢子及分生孢子梗大小。

1.3.3病原菌產(chǎn)孢表型觀察參照張?zhí)煊畹姆椒╗4]，將病原菌接種到PCA平板上，25 ℃下12 h光照、黑暗交替培養(yǎng)1周后，從菌落邊緣切取小塊菌絲塊涂在孔心10 mm的滅菌濾紙上，然后將濾紙放在滅菌載玻片上，置無菌培養(yǎng)皿內(nèi)保濕培養(yǎng)5 d，取出載玻片，進行產(chǎn)孢表型觀察，并照相記錄。

1.3.4自然寄主上病原菌形態(tài)觀察采集田間再力花病葉，用無菌水沖洗后保濕培養(yǎng)48 h，挑取典型病斑上的黑色霉層制作玻片，顯微鏡下觀察分生孢子及分生孢子梗特征，測量分生孢子及分生孢子梗大小。

2結(jié)果與分析

2.1葉斑病病害癥狀

葉斑病主要危害再力花葉片，4月下旬開始發(fā)生，7—9月為發(fā)病盛期。發(fā)病初期為紅褐色針尖狀圓點，后擴展為圓形、橢圓形或不規(guī)則形，病斑中央灰白至灰褐色，斑緣紅褐色，外有黃色暈圈，病健交界明顯（圖1）。發(fā)病后期病斑進一步擴展聯(lián)合成大病斑，葉片上出現(xiàn)灰黑色霉狀物為病原菌子實體，葉正面多于葉背面。發(fā)病嚴重的植株，多數(shù)葉片布滿病斑且干枯死亡，嚴重影響植株的光合作用和觀賞價值。

2.2病原菌致病性測定

用真菌孢子懸浮液接種刺傷的再力花葉片，7 d后開始出現(xiàn)紅褐色針尖狀圓點，后病斑逐漸擴大；接種無傷的葉片

10 d后開始出現(xiàn)感病癥狀；患病葉片表現(xiàn)出的癥狀與田間自然發(fā)病癥狀相似；對照未發(fā)病。從接種后發(fā)病的葉片組織再次分離到該致病菌，這說明該致病菌為葉斑病的病原菌。

2.3病原菌的形態(tài)特征

在PDA培養(yǎng)基上，該病原菌菌絲初期為白色，3 d后菌落灰白色，邊緣白色，背面褐色，后逐漸轉(zhuǎn)為墨綠色至黑色，短絨狀，菌落近圓形，平展，周緣整齊（圖2）；4 d 后菌落直徑為46～49 mm，5 d后菌落直徑達55～58 mm。在PCA培養(yǎng)基上，菌落黑褐色，邊緣灰色，背面褐色，菌落近圓形，絨狀，平展（圖3）；4 d 后菌落直徑為42～44 mm，5 d后菌落直徑達49～52 mm。

3結(jié)論與討論

通過對采集到的再力花病葉病原菌進行分離純化，結(jié)合自然寄主和純培養(yǎng)，對病菌分生孢子和分生孢子梗的大小、形態(tài)、產(chǎn)孢特征等進行觀察，確定導致再力花葉斑病的病原菌為鏈格孢屬鏈格孢菌[Alternaria alternate （Fr.） Keirssler]。

當前，分子生物學方法越來越多的被應用于真菌系統(tǒng)學研究和分類鑒定，尤其是5.8 S rDNA及其兩側(cè)的轉(zhuǎn)錄間區(qū)ITS序列分析適用于種級水平的分類研究[5]。鏈格孢屬小孢子種之間形態(tài)差異不明顯，親緣關(guān)系接近，很難通過ITS序列分析加以區(qū)分，因此，對于小孢子種的區(qū)分仍以形態(tài)學為主。

自然寄主葉片上的鏈格孢菌和PCA培養(yǎng)基上產(chǎn)生的鏈格孢菌，兩者形態(tài)特征較為相似，這說明在PCA培養(yǎng)基上鑒定鏈格孢菌是可行的。鏈格孢菌在PDA培養(yǎng)基和PCA上菌落直徑不同，菌絲在營養(yǎng)豐富的PDA培養(yǎng)基上生長較快，在營養(yǎng)相對匱乏的PCA培養(yǎng)基上生長較慢。另外，鏈格孢菌是鏈格孢屬的模式種，也是廣布的主要小孢子鏈孢種之一，能引起多種植物病害，導致再力花發(fā)生葉斑病為首次報道。再力花葉斑病的生物學特性、侵染循環(huán)、發(fā)病規(guī)律和防治方法等有待進一步研究。

參考文獻：

[1]田軍東，史團省，朱世新，等. 引種植物水竹芋捕蟲行為的初步觀察研究[J]. 世界科技研究與發(fā)展，2007，29（3）：62-65，38.

[2]陳永華，吳曉芙，蔣麗鵑，等. 處理生活污水濕地植物的篩選與凈化潛力評價[J]. 環(huán)境科學學報，2008，28（8）：1549-1554.

[3]王驥，張?zhí)m英，盧少勇，等. 再力花/菖蒲生物濕地床去除河水中氮磷的試驗[J]. 吉林大學學報：地球科學版，2012，42（S1）：408-414.

[4]張?zhí)煊? 中國真菌志：鏈格孢屬[M]. 北京：科學出版社，2003：19-36.

[5]Brower A V Z，Desalle R，Vogler A. Gene trees，species trees，and systematics：a cladistic perspective[J]. Ann Rev Ecol Syst，1996，27：423-450.顧麗嬙 . 殼寡糖對番茄灰霉病菌的抑制作用[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2014，42（9）：115-117.

3結(jié)論與討論

通過對采集到的再力花病葉病原菌進行分離純化，結(jié)合自然寄主和純培養(yǎng)，對病菌分生孢子和分生孢子梗的大小、形態(tài)、產(chǎn)孢特征等進行觀察，確定導致再力花葉斑病的病原菌為鏈格孢屬鏈格孢菌[Alternaria alternate （Fr.） Keirssler]。

當前，分子生物學方法越來越多的被應用于真菌系統(tǒng)學研究和分類鑒定，尤其是5.8 S rDNA及其兩側(cè)的轉(zhuǎn)錄間區(qū)ITS序列分析適用于種級水平的分類研究[5]。鏈格孢屬小孢子種之間形態(tài)差異不明顯，親緣關(guān)系接近，很難通過ITS序列分析加以區(qū)分，因此，對于小孢子種的區(qū)分仍以形態(tài)學為主。

自然寄主葉片上的鏈格孢菌和PCA培養(yǎng)基上產(chǎn)生的鏈格孢菌，兩者形態(tài)特征較為相似，這說明在PCA培養(yǎng)基上鑒定鏈格孢菌是可行的。鏈格孢菌在PDA培養(yǎng)基和PCA上菌落直徑不同，菌絲在營養(yǎng)豐富的PDA培養(yǎng)基上生長較快，在營養(yǎng)相對匱乏的PCA培養(yǎng)基上生長較慢。另外，鏈格孢菌是鏈格孢屬的模式種，也是廣布的主要小孢子鏈孢種之一，能引起多種植物病害，導致再力花發(fā)生葉斑病為首次報道。再力花葉斑病的生物學特性、侵染循環(huán)、發(fā)病規(guī)律和防治方法等有待進一步研究。

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3結(jié)論與討論

通過對采集到的再力花病葉病原菌進行分離純化，結(jié)合自然寄主和純培養(yǎng)，對病菌分生孢子和分生孢子梗的大小、形態(tài)、產(chǎn)孢特征等進行觀察，確定導致再力花葉斑病的病原菌為鏈格孢屬鏈格孢菌[Alternaria alternate （Fr.） Keirssler]。

當前，分子生物學方法越來越多的被應用于真菌系統(tǒng)學研究和分類鑒定，尤其是5.8 S rDNA及其兩側(cè)的轉(zhuǎn)錄間區(qū)ITS序列分析適用于種級水平的分類研究[5]。鏈格孢屬小孢子種之間形態(tài)差異不明顯，親緣關(guān)系接近，很難通過ITS序列分析加以區(qū)分，因此，對于小孢子種的區(qū)分仍以形態(tài)學為主。

自然寄主葉片上的鏈格孢菌和PCA培養(yǎng)基上產(chǎn)生的鏈格孢菌，兩者形態(tài)特征較為相似，這說明在PCA培養(yǎng)基上鑒定鏈格孢菌是可行的。鏈格孢菌在PDA培養(yǎng)基和PCA上菌落直徑不同，菌絲在營養(yǎng)豐富的PDA培養(yǎng)基上生長較快，在營養(yǎng)相對匱乏的PCA培養(yǎng)基上生長較慢。另外，鏈格孢菌是鏈格孢屬的模式種，也是廣布的主要小孢子鏈孢種之一，能引起多種植物病害，導致再力花發(fā)生葉斑病為首次報道。再力花葉斑病的生物學特性、侵染循環(huán)、發(fā)病規(guī)律和防治方法等有待進一步研究。

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