豬流感病毒分子檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

張文慧　李雪嬌　錢愛(ài)東

摘要：豬流感是由豬流感病毒引起的一種急性、高度接觸傳染性豬傳染病，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)危害極大。豬流感病毒也可感染人類，對(duì)人類的生命健康造成威脅。對(duì)豬流感病毒的分子檢測(cè)技術(shù)及我國(guó)豬流感的流行現(xiàn)狀進(jìn)行了綜述。

關(guān)鍵詞：豬流感；流行現(xiàn)狀；分子檢測(cè)

中圖分類號(hào)： S858.28；S852.65+1文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2014）09-0059-02

收稿日期：2013-12-09

基金項(xiàng)目：國(guó)家科技支撐計(jì)劃（編號(hào)：2012BAD04B01-5）。

作者簡(jiǎn)介：張文慧（1977—），女，吉林樺甸人，博士，副教授，從事微生物學(xué)研究。E-mail：215267612@qq.com。

通信作者：錢愛(ài)東，從事微生物學(xué)研究。Tel：（0431）84533426；E-mail：qianaidongO115@163.com。豬流感（swine influenza，SI）是由豬流感病毒（swine influenza virus，SIV）引起的一種急性、高度接觸傳染性豬傳染病。1918年，美國(guó)首次報(bào)道了SI。1930年，Shope分離并鑒定了第一株豬流感病毒SIV A/Swine/Iowa/15/30（H1N1），該病毒被認(rèn)為是美國(guó)20世紀(jì)初發(fā)生的SI病原[1]。該病傳播迅速，往往2～3 d內(nèi)波及全群。康復(fù)豬、隱性感染豬是豬流感病毒的主要儲(chǔ)存宿主，也是豬流感的主要傳染源[2]。該病一年四季都可發(fā)生，在規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)難以根除，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)危害極大。另外，SIV的HA受體結(jié)合位點(diǎn)具有與人流感病毒、禽流感病毒2種流感病毒受體相同的結(jié)合特異性，這決定了SIV不僅可以感染豬，同時(shí)也可感染人類[3]。歷史上SIV感染人的報(bào)道并不罕見(jiàn)。1976年美國(guó)新澤西州一名士兵死于古典H1N1 SIV感染，這是人類歷史上首例SIV致死人的報(bào)道，之后在其他地區(qū)也出現(xiàn)SIV感染人并致死的報(bào)告[4-5]。迄今為止，豬流感已遍及世界各地，已經(jīng)分離出H1N1、H1N2、 H2N3、H3N1、H1N7、H3N3、H4N6、H5N1等多種血清型，其中在豬群中廣泛流行的豬流感病毒主要有古典豬H1N1毒株、類禽H1N1毒株、類人H3N2毒株[6]。本研究對(duì)豬流感病毒的分子檢測(cè)技術(shù)以及豬流感在我國(guó)的流行現(xiàn)狀進(jìn)行綜述，旨在為開(kāi)展豬流感研究提供參考。

1豬流感病毒分子檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

1.1反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）是目前發(fā)展最成熟的分子診斷技術(shù)，可以從基因水平檢測(cè)SIV的RNA，大大縮短了SI病原的檢出時(shí)間，為豬流感的快速診斷提供了更敏感、更快速的方法。該方法具有省時(shí)、省力、靈敏度高、特異性強(qiáng)、診斷速度快等優(yōu)點(diǎn)，已在豬流感病毒檢測(cè)中得到廣泛應(yīng)用[7]。Lee等利用RT-PCR方法分別在臨床樣本中鑒定出H1、H3、N1、N2亞型豬流感病毒[8]。楊煥良等建立了豬流感病毒H1N1、H1N2、H3N2亞型多重RT-PCR診斷方法，可以在2個(gè)反應(yīng)體系中對(duì)豬流感HA、NA基因進(jìn)行亞型鑒定，極大地節(jié)約了人力與時(shí)間[9]。特異性試驗(yàn)檢測(cè)多重RT-PCR不能擴(kuò)增其他豬病毒核酸，核酸最低檢測(cè)量達(dá)2 ng。

1.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-tmie flurescent quantitive polymerase chain reaction）是將熒光基團(tuán)加入PCR反應(yīng)體系中，利用熒光信號(hào)積累對(duì)整個(gè)PCR進(jìn)程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，敏感性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于普通的RT-PCR。實(shí)時(shí)PCR/RT-PCR技術(shù)是將PCR、核酸雜交、信號(hào)放大相結(jié)合的實(shí)時(shí)、在線檢測(cè)的定量PCR技術(shù)，比常規(guī)PCR更靈敏、特異性更強(qiáng)。目前已被廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究、藥物療效分析、病原體檢測(cè)等諸多領(lǐng)域。此方法已被用于A型、B型流感病毒檢測(cè)，檢測(cè)流感病毒的M 基因、HA基因來(lái)區(qū)別A型、B型流感病毒，或是用于區(qū)別A型流感病毒的亞型[10-11]。段廷云等建立了實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)H1N1亞型豬流感病毒，以NP基因的陽(yáng)性重組質(zhì)粒為熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)品模板建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。對(duì)探針濃度、引物濃度、鎂離子濃度、退火溫度進(jìn)行優(yōu)化，建立最佳熒光定量PCR反應(yīng)體系、擴(kuò)增程序[12]。熒光定量PCR的建立為早期診斷豬流感病毒、定量分析豬流感病毒感染程度奠定了基礎(chǔ)。張?zhí)璧冗x取豬流感病毒的NP基因序列設(shè)計(jì)引物、探針，建立了檢測(cè)SIV的TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法[13]。張鵬超等建立的豬流感病毒SYBR Green Ⅰ定量RT-PCR 檢測(cè)方法對(duì)SIV核酸檢測(cè)靈敏度達(dá)30 TCID[14]。陳艷等建立了H3N2亞型豬流感病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR快速檢測(cè)方法[15]。徐敏等建立了以RNA為反應(yīng)模板的一步法熒光定量RT-PCR診斷方法，該方法操作簡(jiǎn)單，可以用RNA作為模板直接檢測(cè)，節(jié)省時(shí)間，特異性好，靈敏度高[16]。張春明等根據(jù)豬流感病毒（SIV） M 基因的保守序列，設(shè)計(jì)并合成1對(duì)特異性引物及TaqMan MGB 探針，建立了SIV M 基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)方法，結(jié)果表明，該方法樣品檢測(cè)與病毒滴定及病毒分離結(jié)果的符合率均達(dá)到100%，特異性強(qiáng)，重復(fù)性好[17]。Real-Time PCR技術(shù)能精確檢測(cè)樣品中SIV的含量，對(duì)SI臨床檢測(cè)診斷具有較強(qiáng)的實(shí)用價(jià)值[18]。

1.3基因芯片

基因芯片技術(shù)指將大量探針?lè)肿庸潭ㄓ谥С治锖?，與標(biāo)記的樣品分子進(jìn)行雜交，通過(guò)檢測(cè)雜交信號(hào)強(qiáng)度而獲取樣品分子的數(shù)量、序列信息。通過(guò)設(shè)計(jì)不同的探針陣列，使用特定的分析方法，可將該技術(shù)用于基因表達(dá)檢測(cè)、突變檢測(cè)、多態(tài)性分析、基因文庫(kù)作圖、雜交測(cè)序、微生物檢測(cè)等領(lǐng)域[19]。陳紅軍等根據(jù)流感病毒血凝素、神經(jīng)氨酸酶、亞型基因序列間的差異性，分別設(shè)計(jì)H1、H3、H9、N1、N2的特異分型引物，根據(jù)M基因設(shè)計(jì)A型流感病毒的通用引物制成基因芯片，并對(duì)217 份不同地區(qū)的樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，該芯片可以同時(shí)檢測(cè)待檢樣品中5種亞型A型流感病毒，并顯示了較高的靈敏度、特異性，靈敏度比PCR 高1個(gè)稀釋度，比病毒分離高2個(gè)稀釋度[20]。楊林等根據(jù)豬流感病毒的M基因序列設(shè)計(jì)了1對(duì)特異性引物，通過(guò)將單鏈PCR產(chǎn)物與芯片雜交實(shí)現(xiàn)對(duì)SIV的檢測(cè)[21]。高淑霞等制備了檢測(cè)H1N1、H3N2、H5N1、H9N2 4種亞型豬流感病毒的基因芯片技術(shù)，與PCR方法相比，該基因芯片技術(shù)顯示了較高的靈敏度[22]。王慧煜等建立了能同時(shí)鑒別甲型H1N1及豬流感病毒常見(jiàn)亞型的新型基因芯片檢測(cè)方法[23]。

2我國(guó)豬流感流行現(xiàn)狀

近年來(lái)，我國(guó)很多學(xué)者分離到不同亞型的SIV[24]。李海燕等對(duì)黑龍江省、吉林省、遼寧省等地豬群進(jìn)行了豬流感血清學(xué)、病原學(xué)調(diào)查研究，從1 306份豬鼻棉拭子樣品及死亡豬肺、氣管樣品中分離到39株H3N2 亞型豬流感病毒、12株H1亞型豬流感病毒及其他亞型豬流感病毒[25]。辛?xí)怨獾冗M(jìn)行了黑龍江省豬流感病原學(xué)及血清學(xué)調(diào)查，1997—2002年共采集到414份豬血清樣品，經(jīng)豬流感血清學(xué)檢查出豬流感陽(yáng)性血清57份，平均陽(yáng)性率為14%；采集到豬的病毒材料275例，經(jīng)技術(shù)處理后接雞胚，分離出豬流感病毒26株，表明有些豬場(chǎng)污染情況比較嚴(yán)重，直接影響豬場(chǎng)的生存及發(fā)展[26]。王隆柏等于2005年8—12月對(duì)福建省豬群豬流感病毒感染情況進(jìn)行調(diào)查，豬流感H1亞型抗體檢測(cè)的平均陽(yáng)性率為530%，豬流感H3亞型抗體檢測(cè)的平均陽(yáng)性率為23.7%，由此可知，福建省豬群不僅存在不同程度的H1、H3亞型SIV感染，而且感染較為普遍[27]。康文彪等在甘肅省11個(gè)市州的豬群中檢出豬流感H3N2抗體陽(yáng)性118份，平均陽(yáng)性率為2789%，其中健康豬血清檢出陽(yáng)性42份，陽(yáng)性率為2234%；患病豬血清檢出陽(yáng)性76份，陽(yáng)性率為32.34%[28]。朱善德等對(duì)浙江省寧波市10個(gè)縣（市、區(qū)）5個(gè)豬場(chǎng)的457份血清進(jìn)行豬流感H3N2抗體檢測(cè)，結(jié)果表明，豬場(chǎng)陽(yáng)性率為2593%，全市豬群平均陽(yáng)性率為16.41%；檢測(cè)健康豬血清373份，陽(yáng)性率達(dá)11%；檢測(cè)發(fā)病豬血清84份，陽(yáng)性率達(dá)4048%[29]。姚敬明等2010年6月至2011年11月在山西省采集了1 018份血樣，用ELISA試劑盒檢測(cè)豬流感血清抗體，陽(yáng)性率為0.98%[30]。禹思宇等2010年6月采用間接ELISA及實(shí)時(shí)熒光RT-PCR技術(shù)，對(duì)湖南省規(guī)模化豬場(chǎng)采集的 1 065 份豬血清、16 796份豬棉拭子、360份肺臟樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，SIV H1N1抗體陽(yáng)性率達(dá)37.84%，H1N1豬流感病毒抗原陽(yáng)性率為0.12%[31]。由此可知，SIV在我國(guó)不同地區(qū)均呈現(xiàn)地方性流行趨勢(shì)，豬群普遍受H1亞型、H3亞型SIV感染。

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