抗鹽玫瑰組培快繁體系的建立

李雪　馬媛春　程宗明

摘要：以抗鹽玫瑰當(dāng)年生去葉的幼嫩單芽莖段為試驗(yàn)材料，建立體外無(wú)性快繁體系。結(jié)果表明，適宜玫瑰離體腋芽發(fā)芽的最佳培養(yǎng)基配方為MS+0.5 mg/L 6-BA和MS+1.5 mg/L 6-BA；適宜叢生芽繼代增殖的最佳培養(yǎng)基配方為MS+1.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IBA和3/4MS+0.3 mg/L IBA；適宜組培苗生根的最佳培養(yǎng)基配方為1/2MS+03 mg/L NAA，其生根率可達(dá)95%。生根苗木移栽成活率可達(dá)87%以上。該體系可以用于抗鹽玫瑰的快速大量繁殖。

關(guān)鍵詞：抗鹽玫瑰；組培快繁體系；培養(yǎng)基；萌發(fā)；繼代培養(yǎng)；生根誘導(dǎo)；移栽馴化

中圖分類號(hào)： S685.120.4+3文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2014）09-0050-04

收稿日期：2014-04-05

基金項(xiàng)目：江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金[編號(hào)：CX（14）2051]。

作者簡(jiǎn)介：李雪（1987—），女，山東德州人，碩士研究生，主要從事園藝植物生物技術(shù)研究。E-mail：smilexueok@163.com。

通信作者：程宗明，博士，教授，主要從事果實(shí)系統(tǒng)生物學(xué)研究。E-mail：zmc@njau.edu.cn。玫瑰（Rosa rugosa L.）是薔薇科薔薇屬植物，廣泛分布在東亞、歐洲和北美洲地區(qū)。它花型秀美，色彩艷麗，氣味芳香，形色俱佳。玫瑰花朵主要用于提煉香精玫瑰油，玫瑰油比等重量黃金價(jià)值還高，主要應(yīng)用于化妝品、食品、精細(xì)化工等。玫瑰花瓣還可直接被腌制成食品，作調(diào)味劑使用，同時(shí)它的干燥花蕾也是一種重要的傳統(tǒng)中藥材[1]。經(jīng)測(cè)定，玫瑰的果實(shí)中含有大量的維生素A、維生素B、維生素C，還含有10多種氨基酸、可溶性糖、生物堿和無(wú)機(jī)元素等[2-4]。常食玫瑰果可以預(yù)防冠心病、肝病、急慢性傳染病和阻止產(chǎn)生致癌物質(zhì)等。玫瑰果實(shí)還常常被用來(lái)制作成濃縮維生素制劑。此外，玫瑰還具有較強(qiáng)的抗逆性[5]。玫瑰種子發(fā)芽慢，扦插繁殖困難，采用組織培養(yǎng)的方法繁殖玫瑰，不但生產(chǎn)周期短，繁殖系數(shù)高，而且成本低，經(jīng)濟(jì)效益很高。江蘇省東部沿海灘涂鹽堿濃度高，極少園林和觀賞植物能夠在此生長(zhǎng)。近幾年來(lái)，筆者試種的一些抗鹽玫瑰單株具有較強(qiáng)耐鹽能力，利用這些耐鹽單株建立玫瑰離體快繁體系，是實(shí)現(xiàn)良種快繁以及產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的客觀需求。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

該供試材料為當(dāng)年生實(shí)生苗，種子來(lái)自美國(guó)海濱，經(jīng)過(guò)3個(gè)月沙藏保存后于翌年3月初播種，其盛花期見(jiàn)圖1。

1.2方法

1.2.1外植體的消毒處理3月中旬從優(yōu)良健壯植株剪取當(dāng)年生枝條中段帶芽的幼嫩莖段，用毛刷蘸取洗衣粉水輕輕刷洗后，剪成5.0 cm左右莖條，再流水沖洗2 h左右。在超凈工作臺(tái)上，先將莖段用70%乙醇溶液消毒30 s，用無(wú)菌水沖洗2～3次，然后置于0.1%HgCl2溶液中消毒3～5 min，再用無(wú)菌水沖洗3～5次。用無(wú)菌濾紙吸干材料表面的水分，最后將幼嫩莖條剪切成1.0 cm左右的帶芽莖段，接種[6]。

1.2.2腋芽的萌發(fā)誘導(dǎo)將已處理的無(wú)菌莖段接種于腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)?；菊T導(dǎo)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，對(duì)基本培養(yǎng)基添加不同濃度的細(xì)胞分裂素6-BA（6-benzylaminopurine，6-芐氨基腺嘌呤）、大量元素和有機(jī)元素，共組成5種配方的培養(yǎng)基：MS+0.5 mg/L 6-BA、MS+1.5 mg/L 6-BA、MS+2.5 mg/L 6-BA、3/2MS+2.5 mg/L 6-BA、MS+2.5 mg/L 6-BA（有機(jī)元素為1.5倍）。每種培養(yǎng)基上均接種30個(gè)離體莖段，每個(gè)處理重復(fù)3次，首先暗培養(yǎng)處理5 d，以減輕外植體的褐化現(xiàn)象[7-9]，培養(yǎng)4周后統(tǒng)計(jì)腋芽萌發(fā)率。

1.2.3繼代增殖培養(yǎng)將誘導(dǎo)培養(yǎng)基上已經(jīng)萌發(fā)的嫩芽剪切下來(lái)轉(zhuǎn)接到繼代培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，共設(shè)8種繼代培養(yǎng)基：MS+ 0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA、MS+0.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IBA、MS+1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA、MS+1.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IBA、MS+0.5 mg/L 6-BA+01 mg/L NAA、MS+0.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA、MS+0.3 mg/L IBA、3/4MS+0.3 mg/L IBA。每種培養(yǎng)基均接種20個(gè)0.5～1.0 cm長(zhǎng)的單芽莖段，每個(gè)處理重復(fù)3次，培養(yǎng)30 d后，統(tǒng)計(jì)莖高≥2.0 cm的苗的數(shù)量。

1.2.4生根培養(yǎng)從繼代培養(yǎng)苗中選取生長(zhǎng)健壯的幼苗，轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上，共組成5種生根培養(yǎng)基：1/2MS+0.1 mg/L NAA、1/2MS+0.3 mg/L NAA、1/2MS+0.5 mg/L NAA、1/2MS+0.3 mg/L IBA、1/2MS+0.4 mg/L IBA。每種培養(yǎng)基均接種20個(gè)幼苗，每個(gè)處理重復(fù)3次，接種20 d后統(tǒng)計(jì)幼苗的生根情況。

1.2.5組培苗的馴化移栽

1.2.5.1組培苗的馴化將長(zhǎng)勢(shì)良好、株高5.0 cm以上的生根組培苗的瓶蓋擰松，放置5 d后開(kāi)始每天倒入約3 mm厚的無(wú)菌水并逐漸開(kāi)蓋，7 d后時(shí)徹底揭開(kāi)瓶蓋，在持續(xù)該環(huán)境下觀察3 d。擰松瓶蓋后須每天添加無(wú)菌水，這樣不但能夠防止培養(yǎng)基被徹底風(fēng)干，還能為組培苗補(bǔ)充適當(dāng)?shù)乃帧?/p>

1.2.5.2組培苗的移栽將長(zhǎng)勢(shì)依舊健壯且無(wú)污染的幼苗用鑷子從組培瓶中小心取出，再用無(wú)菌水輕輕將附著的培養(yǎng)基洗掉，注意不要傷根。同時(shí)剪掉幼苗基部葉片，僅保留頂端3～5張復(fù)葉，再移栽到光照培養(yǎng)箱中。移栽所用的基質(zhì)先121 ℃、30 min高壓蒸汽滅菌，基質(zhì)中蛭石 ∶草炭土 ∶珍珠巖為9 ∶3 ∶1.5，移栽完畢后澆透水，并用0.1%多菌靈溶液噴霧保苗。培養(yǎng)箱溫度設(shè)置為22 ℃，晝夜溫差2～3 ℃，相對(duì)濕度為90%，光照強(qiáng)度為100 μmol/（m2·s），光照時(shí)間為12 h/d，其間噴水2～3次/d，同時(shí)注意防治病菌。移栽5 d后可以增加光照強(qiáng)度并且適當(dāng)降低澆水量[10]。

1.2.6統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)分析采用Excel和SPSS軟件進(jìn)行。

2結(jié)果與分析

2.1離體芽的誘導(dǎo)

之前預(yù)試驗(yàn)中采芽時(shí)間分別為3月中旬、5月中旬、7月中旬、9月中旬、10月中旬，結(jié)果以3月采芽試驗(yàn)效果最好，因此正式試驗(yàn)都采用3月的取樣。玫瑰離體莖段接種2周后離體芽幾乎全部萌發(fā)，但芽萌動(dòng)后的生長(zhǎng)狀況卻因培養(yǎng)基內(nèi)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度的不同而表現(xiàn)出差異。由表1可以看出，MS+2.5 mg/L 6-BA培養(yǎng)基上叢生芽少，節(jié)間極短，芽苗矮小；3/2MS+2.5 mg/L 6-BA培養(yǎng)基上分化率達(dá)157%，但節(jié)間極短；培養(yǎng)基MS+2.5 mg/L 6-BA（有機(jī)元素為1.5倍）上，叢生芽最少，節(jié)間短，芽苗矮小。以上3種培養(yǎng)基上芽苗均長(zhǎng)勢(shì)矮壯，說(shuō)明細(xì)胞分裂素6-BA濃度過(guò)高反而會(huì)抑制生長(zhǎng)[11]，增加大量元素含量和有機(jī)元素含量也并不利于玫瑰腋芽萌發(fā)。培養(yǎng)基MS+1.5 mg/L 6-BA和MS+0.5 mg/L 6-BA上分化率都高達(dá)170%，與其他處理差異顯著，叢生芽多且生長(zhǎng)健壯，雖然6-BA濃度為0.5 mg/L時(shí)莖稈稍細(xì)，但是并不影響其繼代生長(zhǎng)。重復(fù)試驗(yàn)篩選出適宜離體芽誘導(dǎo)分化的培養(yǎng)基配方為MS+0.5 mg/L 6-BA（圖2）和MS+1.5 mg/L 6-BA（圖3）。

2.2叢生芽的繼代培養(yǎng)

繼代增殖培養(yǎng)基采用的生長(zhǎng)素為NAA（1-nnaphthaleneacetic acid，萘乙酸）和IBA（3-indolebutyricacid，3-吲哚丁酸）。玫瑰在8種繼代增殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)4周后，芽的增殖倍數(shù)和生長(zhǎng)情況存在差異。由表2可以看出，玫瑰在培養(yǎng)基MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA和培養(yǎng)基MS+0.5 mg/L 6-BA +0.3 mg/L NAA上分別于3、5 d后開(kāi)始出現(xiàn)葉片萎蔫現(xiàn)象，不久后死亡，說(shuō)明生長(zhǎng)素NAA和6-BA的組合并不適合這種玫瑰的繼代增殖培養(yǎng)。玫瑰在培養(yǎng)基MS+1.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IBA上增殖倍數(shù)高達(dá)3.6，與其他處理差異顯著，叢生芽多且生長(zhǎng)健壯；MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA培養(yǎng)基上叢生芽少且有畸形苗；MS+0.5 mg/L 6-BA +0.3 mg/L IBA培養(yǎng)基上叢生芽少，葉粗厚變脆；MS+1.5 mg/L 6-BA +0.1 mg/L IBA 培養(yǎng)基上叢生芽最少，節(jié)間極短，苗叢密集，微型化。說(shuō)明細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素的用量及配比對(duì)玫瑰的繼代增殖都有重要影響。MS+0.3 mg/L IBA培養(yǎng)基上叢生芽較少，速度慢，個(gè)別苗生長(zhǎng)細(xì)弱，而3/4MS+0.3 mg/L IBA培養(yǎng)基上增殖倍數(shù)高達(dá)3.8，與其他處理差異顯著，叢生芽多且生長(zhǎng)健壯，說(shuō)明調(diào)節(jié)大量元素含量可有效提高繁殖系數(shù)。重復(fù)試驗(yàn)篩選出適宜玫瑰繼代增殖的培養(yǎng)基配方為MS+1.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IBA（圖4）和3/4MS+0.3 mg/L IBA（圖5）。

2.3組培苗的生根培養(yǎng)

由表3可以明顯看出，生長(zhǎng)素NAA較IBA對(duì)抗鹽玫瑰的組培誘導(dǎo)生根誘導(dǎo)效果更好。培養(yǎng)基1/2MS+0.1 mg/L NAA和1/2MS+0.3 mg/L IBA上組培苗生根率均為50%，平均根數(shù)分別為4條和5條，并且根系粗短；1/2MS+0.4 mg/L IBA培養(yǎng)基上組培苗生根率達(dá)75%，平均根數(shù)約為3.33條，雖然這種培養(yǎng)基比IBA濃度為0.3 mg/L時(shí)根系稍長(zhǎng)，但由于根系細(xì)弱也不適于移栽（圖6）；在培養(yǎng)基1/2MS + 0.3 mg/L NAA和培養(yǎng)基1/2MS+0.5 mg/L NAA上，組培苗生根率均高達(dá)95%，與其他處理差異顯著，但是隨著NAA濃度升高，

平均生根數(shù)反而減少，因此NAA濃度為0.5 mg/L時(shí)并不適合誘導(dǎo)生根。

在中間繁殖體增殖到一定數(shù)量即開(kāi)始進(jìn)行生根培養(yǎng)，由于嫩莖中細(xì)胞分裂素的累積，在轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基后增殖的趨勢(shì)往往仍然很強(qiáng)，幾乎沒(méi)有不定根的發(fā)生。因此，生根培養(yǎng)要降低細(xì)胞分裂素濃度，增加生長(zhǎng)素濃度[12-13]。重復(fù)試驗(yàn)篩選出誘導(dǎo)玫瑰組培苗生根的最佳培養(yǎng)基配方為1/2MS+0.3 mg/L NAA（圖7），且根系良好，適于移栽。

2.4組培苗的馴化移栽

玫瑰組培苗馴化移栽15 d后，就可以過(guò)渡到正常溫室或自然條件下生長(zhǎng)（圖8）。經(jīng)重復(fù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，只要按照上述程

3結(jié)論與討論

在抗鹽玫瑰的腋芽誘導(dǎo)時(shí)期，以MS+0.5 mg/L 6-BA和MS+1.5 mg/L 6-BA這2種培養(yǎng)基配方的效果最佳；在繼代與增殖時(shí)期，以MS+1.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IBA和3/4MS+0.3 mg/L IBA這2種培養(yǎng)基的效果最佳；在組培苗的誘導(dǎo)生根時(shí)期，以1/2MS+0.3 mg/L NAA培養(yǎng)基的效果最佳。

在玫瑰的繼代增殖培養(yǎng)階段發(fā)現(xiàn)，不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的配比是影響叢生芽繼代增殖的關(guān)鍵。生長(zhǎng)素IBA與6-BA結(jié)合比NAA與6-BA結(jié)合更加適合這種玫瑰的繼代增殖培養(yǎng)。然而在玫瑰的生根培養(yǎng)中，生長(zhǎng)素NAA卻比IBA更利于促進(jìn)玫瑰的生根，應(yīng)用生長(zhǎng)素IBA誘導(dǎo)的根普遍細(xì)弱。因此不同的生長(zhǎng)階段對(duì)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的需求不同。

采用組織培養(yǎng)的方法繁殖玫瑰，生產(chǎn)周期短，整個(gè)周期僅4個(gè)月，且繁殖系數(shù)高，成本低，應(yīng)有很高的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。另外，組培快繁技術(shù)可以保證種苗生長(zhǎng)一致，并且能夠克服種子繁殖苗木所帶來(lái)的觀賞性狀不一致的缺點(diǎn)，提高苗木的商品規(guī)格，有利于進(jìn)行玫瑰的工廠化生產(chǎn)，為良種快繁以及產(chǎn)業(yè)化發(fā)展奠定基礎(chǔ)。本試驗(yàn)建立了抗鹽玫瑰從初代、繼代到生根離體快繁的完整體系，將為工廠化生產(chǎn)提供依據(jù)，且該試驗(yàn)大量擴(kuò)繁選育的抗鹽玫瑰單株，也將于江蘇省東部沿海進(jìn)行區(qū)域試驗(yàn)。

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