農(nóng)桿菌滲透法轉(zhuǎn)化煙草條件的優(yōu)化

李曉君　王紹梅　謝艷蘭　和敏

摘要：植物瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)常用于研究基因表達(dá)產(chǎn)物的亞細(xì)胞定位和蛋白間的互作，將GFP-GUS融合蛋白植物表達(dá)載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105，獲得工程菌，制備不同濃度的農(nóng)桿菌浸染液，用注射法對(duì)煙草葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)化，熒光顯微鏡檢測(cè)煙草葉片原生質(zhì)體和下表皮中GFP的表達(dá)情況。結(jié)果表明，浸染注射液的D600 nm 在0.3～0.7之間均具有較高的轉(zhuǎn)化效率，注射后第4天至第6天為較佳觀察時(shí)間。

關(guān)鍵詞：植物瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)；滲透法；轉(zhuǎn)化；農(nóng)桿菌滲透注射；煙草；綠色熒光蛋白（GFP）

中圖分類號(hào)： S572.01文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2014）09-0045-03

收稿日期：2013-11-25

基金項(xiàng)目：臨滄師范高等專科學(xué)校高層次人才引進(jìn)科研啟動(dòng)項(xiàng)目（編號(hào)：LXJ2012）；臨滄師范高等?？茖W(xué)校校級(jí)課題（編號(hào)：LCSZL2013001 ）

。

作者簡(jiǎn)介：李曉君（1985—），女，云南臨滄人，博士，講師，主要從事植物生物技術(shù)與種質(zhì)創(chuàng)新研究。E-mail：lxj-148@163.com。植物瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)常用于基因產(chǎn)物的亞細(xì)胞定位、蛋白間互作、轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子之間的互作、啟動(dòng)子分析等方面的研究[1-2]。植物瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)中外源基因的導(dǎo)入方法有植物病毒介導(dǎo)法、PEG法、電擊法、基因槍法和農(nóng)桿菌滲透法[2]。農(nóng)桿菌滲透法是一種比較簡(jiǎn)便的方法，通過將植物表達(dá)載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌，用真空法或注射法將農(nóng)桿菌導(dǎo)入植物細(xì)胞，使得農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒上的T-DNA區(qū)整合到植物基因組中，T-DNA 區(qū)的目標(biāo)基因培養(yǎng)幾天后即可得到表達(dá)[3]。較其他方法而言，農(nóng)桿菌滲透法具有轉(zhuǎn)化效率高、基因表達(dá)在完整活體內(nèi)進(jìn)行、可攜帶較大片段的目的基因等優(yōu)點(diǎn)[2]。原生質(zhì)體是觀察基因瞬時(shí)表達(dá)情況的優(yōu)選材料，傳統(tǒng)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法首先要制備高濃度、高質(zhì)量的質(zhì)粒，經(jīng)過從植物活體材料中分離純化原生質(zhì)體，在PEG的介導(dǎo)下將質(zhì)粒DNA導(dǎo)入原生質(zhì)體，進(jìn)行原生質(zhì)體培養(yǎng)后再檢測(cè)目標(biāo)基因的表達(dá)情況[4]。用該方法轉(zhuǎn)化后的原生質(zhì)體敏感、易破裂，使得陽性細(xì)胞檢出率低，不利于觀察。以農(nóng)桿菌滲透法轉(zhuǎn)化材料提取原生質(zhì)體，可縮短從原生質(zhì)體提取到觀察的時(shí)間，原生質(zhì)體完整，鏡檢陽性率高。本研究在Sparke等的研究基礎(chǔ)[5]上簡(jiǎn)化了農(nóng)桿菌注射液的制備和注射過程，通過熒光顯微鏡觀察注射區(qū)域下表皮和原生質(zhì)體中綠色熒光蛋白（GFP）的表達(dá)情況，檢測(cè)不同注射濃度下和注射后不同時(shí)間的轉(zhuǎn)化效率，總結(jié)出一種高效簡(jiǎn)易的農(nóng)桿菌滲透注射轉(zhuǎn)化煙草的方法。

1材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1植物材料將普通煙草（Nicotiana tabacum）種子播撒在育苗盤中，2周后移至小花盆，5～6周后即可作為轉(zhuǎn)化受體。

1.1.2菌種和質(zhì)粒農(nóng)桿菌EHA105為臨滄師范高等?？茖W(xué)校農(nóng)學(xué)系植物生理實(shí)驗(yàn)室保存，植物表達(dá)載體pCAMBIA1304圖譜如圖1（空載體表達(dá)GFP-GUS基因，亞細(xì)胞定位特點(diǎn)：細(xì)胞質(zhì)[6]）所示。

1.1.3試驗(yàn)儀器和用具低溫高速離心機(jī)（MIKR V22R，HETTICH）、搖床（G-27，EKISO）、熒光顯微鏡（TCS-SP5LEICA）、5 mL 一次性注射器[生工生物工程（上海）

股份有限公司]、低溫冰箱（海爾）。

1.2試劑配制

本試驗(yàn)所用藥品及試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。（1）母液6種。包括0.2 mol/L MES（2-N-嗎啉代乙磺酸）、0.8 mol/L 甘露醇、1 mol/L CaCl2、2 mol/L KCl、1 mol/L乙酰丁香酮、1 mol/L Na3PO4·12H2O。除了甘露醇母液外，其他均4 ℃保存。（2）YEB液體培養(yǎng)基。包括10 g/L酵母膏、5 g/L蛋白胨、5 g/L蔗糖、1 g/L MgSO4。121 ℃滅菌25 min，冷卻，加入3種抗生素（終濃度10 mg/L 卡那霉素、25 mg/L鏈霉素、50 mg/L 利福平），4 ℃保存。（3）注射培養(yǎng)基。包括10 g/L D-果糖、50 mmol/L MES、10 mmol/L CaCl2、2 mmol/L Na3PO4·12H2O、0.1 mmol/L 乙酰丁香酮，現(xiàn)用現(xiàn)配。（4）原生質(zhì)體提取溶液Ⅰ。包括15 mg/mL 纖維素酶、5 mg/mL 離析酶、20 mmol/L MES、400 mmol/L 甘露醇、20 mmol/L KCl，現(xiàn)用現(xiàn)配。（5）原生質(zhì)體提取溶液Ⅱ。包括5 mL 1 mol/L CaCl2、5 mL 10% BSA、1 mL β-ME，現(xiàn)配現(xiàn)用，配制后用 0.45 μm 濾頭過濾。（6）W5溶液。包括 2 mmol/L MES、154 mmol/L NaCl、125 mmol/L CaCl2、5mmol/L KCl，可提前配制，4 ℃保存。（7）MMG溶液。包括400 mmol/L 甘露醇、15 mmol/L MgCl2、4 mmol/L MES，可提前配制，4 ℃保存。

1.3農(nóng)桿菌滲透注射法轉(zhuǎn)化煙草

1.3.1工程菌的獲得和活化用凍融法將pCAMBIA1304質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞，獲得工程菌株，低溫保存。將10 μL工程菌種接入5 mL的YEB液體培養(yǎng)基（含 10 mg/L 卡那霉素、25 mg/L鏈霉素、50 mg/L 利福平） 中活化12 h（28 ℃，200 r/min）。

1.3.2注射液的準(zhǔn)備菌體活化后，按照1 ∶100的體積比進(jìn)行轉(zhuǎn)搖（28 ℃，200 r/min），培養(yǎng)5～6 h，離心，收集菌體（室溫、1 000 g、10 min），加入1/2菌液體積的注射培養(yǎng)基進(jìn)行重懸，室溫下1 000 g離心10 min，棄上清，重復(fù)1次，去除殘留的抗生素；將菌體用注射培養(yǎng)基進(jìn)行重懸，用注射培養(yǎng)基稀釋菌體至7個(gè)濃度，其對(duì)應(yīng)的D600 nm為0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.2、1.5，此時(shí)配制得菌體注射液，此注射液可室溫放置4～5 h，也可立即使用。

1.3.3注射法轉(zhuǎn)化注射前將煙草在日光燈下培養(yǎng)2～3 h，以便煙草氣孔張開而有利于注射。選擇煙草植株中部較大的2張葉片進(jìn)行注射，先用去掉針頭的注射器輕輕擦除無主脈處的下表皮蠟質(zhì)，形成注射點(diǎn)；用無針頭的注射器吸取0.5～1.0 mL的菌體注射液，左手扶著注射葉片正面，右手將菌體注射液由注射點(diǎn)輕輕地推入，每個(gè)點(diǎn)注射量以注射液無法在葉背面擴(kuò)散為止，每個(gè)葉片注射不超過4個(gè)點(diǎn)，每個(gè)濃度的注射液注射5個(gè)植株。注射后，用標(biāo)記筆標(biāo)記注射液擴(kuò)散的范圍。為了防止操作失誤引起的注射液噴射，在注射的過程中要帶口罩、手套和眼鏡。如果同時(shí)進(jìn)行多個(gè)工程菌的注射，在注射不同的菌前更換1次手套，防止交叉污染。注射完后，將煙草放置于培養(yǎng)箱中，如果天氣晴朗，也可直接置于大棚內(nèi)培養(yǎng)，隔天澆1次水。

1.4顯微觀察目標(biāo)蛋白表達(dá)情況

由于pCAMBIA1304表達(dá)的為GUS-GFP融合基因，因此可以通過GUS染色和熒光顯微觀察2種途徑進(jìn)行目的蛋白表達(dá)的檢測(cè)。本研究通過熒光顯微觀察方法進(jìn)行GFP蛋白表達(dá)的檢測(cè)。（1）直接觀察法。注射后第2天開始，每天撕取一小片（1 cm2左右）的注射液擴(kuò)散范圍的煙草下表皮，放在載玻片上（滴水），蓋上蓋玻片，用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，連續(xù)觀察7 d，檢測(cè)陽性細(xì)胞的比例。（2）原生質(zhì)體觀察法。轉(zhuǎn)化后第4天，收集各個(gè)菌液濃度處理的3個(gè)植株葉片，每個(gè)植株取1.5 cm2左右，混樣提取原生質(zhì)體。原生質(zhì)體提取參照RAO等的方法[7]，先根據(jù)樣品配制提取溶液Ⅰ（每份樣品5 mL），將提取酶液溶液Ⅰ在55 ℃下溫育10 min，冷卻后加入提取溶液Ⅱ（每份樣品110 μL）；將葉片切成1 mm寬的細(xì)條，放入酶液Ⅰ和酶液Ⅱ的混合液中，用鑷子打散；抽真空 20 min 后消化3 h，搖勻，在裂解液中加入W5溶液稀釋（每份樣品5 mL），用300目鋼網(wǎng)過濾雜質(zhì)和碎片。將濾液吸入 2 mL 離心管中，100 g離心2 min后小心將離心管置于冰上15 min，去上清，加入MMG溶液調(diào)整各個(gè)樣品的原生質(zhì)體濃度至基本一致，約100 萬個(gè)/mL。用熒光顯微鏡進(jìn)行檢測(cè)各個(gè)樣品的陽性細(xì)胞比例，統(tǒng)計(jì)3個(gè)10倍鏡視野下的陽性細(xì)胞占正常原生質(zhì)體的比例，在明場(chǎng)下檢測(cè)完整原生質(zhì)體占視野中總原生質(zhì)體的比例，以未注射的煙草作為以上2個(gè)觀察試驗(yàn)的空白對(duì)照。

2結(jié)果與分析

2.1轉(zhuǎn)化煙草下表皮觀察

轉(zhuǎn)化后第2天開始，每天撕取不同濃度菌液注射后的煙草植株葉片的下表皮用熒光顯微觀察GFP的表達(dá)情況，由表1可見，除了D600 nm 為0.1的注射樣品外，在注射后第3天均可在煙草葉片下表皮中觀察到綠色熒光，而注射濃度D600 nm為0.3～07之間的注射樣品在第4天和第7天均可檢測(cè)到較強(qiáng)的綠色熒光。菌液濃度D600 nm>0.9時(shí)會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率；注射液D600 nm為0.5時(shí)，GFP的表達(dá)強(qiáng)度在第4天至第6天最好。

2.2菌液注射濃度對(duì)轉(zhuǎn)化效率和原生質(zhì)體成活率的影響

轉(zhuǎn)化后第4天，提取不同濃度菌液注射后的煙草葉片原生質(zhì)體進(jìn)行觀察，對(duì)GFP陽性細(xì)胞的比率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并在明場(chǎng)下統(tǒng)計(jì)破損原生質(zhì)體的比例，結(jié)果如圖2所示。當(dāng)D600 nm為0.1或大于0.9時(shí)，陽性細(xì)胞的檢出率均低于20%；而在0.3～07 之間時(shí)，陽性細(xì)胞檢出率均在30%以上；0.5則為最佳轉(zhuǎn)化濃度，轉(zhuǎn)化率達(dá)45%，原生質(zhì)體較為完整，轉(zhuǎn)化效率較高。隨著注射濃度的增加，菌液對(duì)葉片細(xì)胞的傷害增強(qiáng)，當(dāng)D600 nm>0.9時(shí)，提取的原生質(zhì)體成活率降低至60%以下。圖3為轉(zhuǎn)化后第4天注射菌液濃度D600 nm為0.5時(shí)注射區(qū)域煙草下表皮和原生質(zhì)體中GFP的表達(dá)情況。

3結(jié)論

農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化煙草的瞬時(shí)表達(dá)常常通過離體滲透法，也可通過注射法進(jìn)行[8-9]。本研究所用的農(nóng)桿菌滲透轉(zhuǎn)化法在轉(zhuǎn)化過程中只需配制菌體培養(yǎng)液和注射液，注射液現(xiàn)配現(xiàn)用，比較方便快捷。通過熒光顯微鏡在細(xì)胞水平對(duì)轉(zhuǎn)化效率進(jìn)行分析，并分析注射液濃度對(duì)原生質(zhì)體成活率的影響，結(jié)果表明注射液的濃度對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有重要影響，注射液濃度D600 nm 為0.3～0.7時(shí)均能得到理想的結(jié)果，在第4天至第6天時(shí)進(jìn)行檢測(cè)最為合適。在亞細(xì)胞定位研究中，利用 X-GFP-GUS 融合蛋白表達(dá)系統(tǒng)，其優(yōu)點(diǎn)是在檢測(cè)目標(biāo)蛋白的表達(dá)時(shí)，既可以通過GUS染色的方法觀察目的基因在植物不同組織和不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)情況，也可以直接通過顯微觀察細(xì)胞中的GFP熒光信號(hào)分析目的基因的亞細(xì)胞定位和蛋白互作情況；且X-GFP-GUS融合蛋白分子量較大，可以防止融合蛋白自由擴(kuò)散，對(duì)于目的蛋白分子量較小的基因可以減少定位誤差[10]。

參考文獻(xiàn)：

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1.3.3注射法轉(zhuǎn)化注射前將煙草在日光燈下培養(yǎng)2～3 h，以便煙草氣孔張開而有利于注射。選擇煙草植株中部較大的2張葉片進(jìn)行注射，先用去掉針頭的注射器輕輕擦除無主脈處的下表皮蠟質(zhì)，形成注射點(diǎn)；用無針頭的注射器吸取0.5～1.0 mL的菌體注射液，左手扶著注射葉片正面，右手將菌體注射液由注射點(diǎn)輕輕地推入，每個(gè)點(diǎn)注射量以注射液無法在葉背面擴(kuò)散為止，每個(gè)葉片注射不超過4個(gè)點(diǎn)，每個(gè)濃度的注射液注射5個(gè)植株。注射后，用標(biāo)記筆標(biāo)記注射液擴(kuò)散的范圍。為了防止操作失誤引起的注射液噴射，在注射的過程中要帶口罩、手套和眼鏡。如果同時(shí)進(jìn)行多個(gè)工程菌的注射，在注射不同的菌前更換1次手套，防止交叉污染。注射完后，將煙草放置于培養(yǎng)箱中，如果天氣晴朗，也可直接置于大棚內(nèi)培養(yǎng)，隔天澆1次水。

1.4顯微觀察目標(biāo)蛋白表達(dá)情況

由于pCAMBIA1304表達(dá)的為GUS-GFP融合基因，因此可以通過GUS染色和熒光顯微觀察2種途徑進(jìn)行目的蛋白表達(dá)的檢測(cè)。本研究通過熒光顯微觀察方法進(jìn)行GFP蛋白表達(dá)的檢測(cè)。（1）直接觀察法。注射后第2天開始，每天撕取一小片（1 cm2左右）的注射液擴(kuò)散范圍的煙草下表皮，放在載玻片上（滴水），蓋上蓋玻片，用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，連續(xù)觀察7 d，檢測(cè)陽性細(xì)胞的比例。（2）原生質(zhì)體觀察法。轉(zhuǎn)化后第4天，收集各個(gè)菌液濃度處理的3個(gè)植株葉片，每個(gè)植株取1.5 cm2左右，混樣提取原生質(zhì)體。原生質(zhì)體提取參照RAO等的方法[7]，先根據(jù)樣品配制提取溶液Ⅰ（每份樣品5 mL），將提取酶液溶液Ⅰ在55 ℃下溫育10 min，冷卻后加入提取溶液Ⅱ（每份樣品110 μL）；將葉片切成1 mm寬的細(xì)條，放入酶液Ⅰ和酶液Ⅱ的混合液中，用鑷子打散；抽真空 20 min 后消化3 h，搖勻，在裂解液中加入W5溶液稀釋（每份樣品5 mL），用300目鋼網(wǎng)過濾雜質(zhì)和碎片。將濾液吸入 2 mL 離心管中，100 g離心2 min后小心將離心管置于冰上15 min，去上清，加入MMG溶液調(diào)整各個(gè)樣品的原生質(zhì)體濃度至基本一致，約100 萬個(gè)/mL。用熒光顯微鏡進(jìn)行檢測(cè)各個(gè)樣品的陽性細(xì)胞比例，統(tǒng)計(jì)3個(gè)10倍鏡視野下的陽性細(xì)胞占正常原生質(zhì)體的比例，在明場(chǎng)下檢測(cè)完整原生質(zhì)體占視野中總原生質(zhì)體的比例，以未注射的煙草作為以上2個(gè)觀察試驗(yàn)的空白對(duì)照。

2結(jié)果與分析

2.1轉(zhuǎn)化煙草下表皮觀察

轉(zhuǎn)化后第2天開始，每天撕取不同濃度菌液注射后的煙草植株葉片的下表皮用熒光顯微觀察GFP的表達(dá)情況，由表1可見，除了D600 nm 為0.1的注射樣品外，在注射后第3天均可在煙草葉片下表皮中觀察到綠色熒光，而注射濃度D600 nm為0.3～07之間的注射樣品在第4天和第7天均可檢測(cè)到較強(qiáng)的綠色熒光。菌液濃度D600 nm>0.9時(shí)會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率；注射液D600 nm為0.5時(shí)，GFP的表達(dá)強(qiáng)度在第4天至第6天最好。

2.2菌液注射濃度對(duì)轉(zhuǎn)化效率和原生質(zhì)體成活率的影響

轉(zhuǎn)化后第4天，提取不同濃度菌液注射后的煙草葉片原生質(zhì)體進(jìn)行觀察，對(duì)GFP陽性細(xì)胞的比率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并在明場(chǎng)下統(tǒng)計(jì)破損原生質(zhì)體的比例，結(jié)果如圖2所示。當(dāng)D600 nm為0.1或大于0.9時(shí)，陽性細(xì)胞的檢出率均低于20%；而在0.3～07 之間時(shí)，陽性細(xì)胞檢出率均在30%以上；0.5則為最佳轉(zhuǎn)化濃度，轉(zhuǎn)化率達(dá)45%，原生質(zhì)體較為完整，轉(zhuǎn)化效率較高。隨著注射濃度的增加，菌液對(duì)葉片細(xì)胞的傷害增強(qiáng)，當(dāng)D600 nm>0.9時(shí)，提取的原生質(zhì)體成活率降低至60%以下。圖3為轉(zhuǎn)化后第4天注射菌液濃度D600 nm為0.5時(shí)注射區(qū)域煙草下表皮和原生質(zhì)體中GFP的表達(dá)情況。

3結(jié)論

農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化煙草的瞬時(shí)表達(dá)常常通過離體滲透法，也可通過注射法進(jìn)行[8-9]。本研究所用的農(nóng)桿菌滲透轉(zhuǎn)化法在轉(zhuǎn)化過程中只需配制菌體培養(yǎng)液和注射液，注射液現(xiàn)配現(xiàn)用，比較方便快捷。通過熒光顯微鏡在細(xì)胞水平對(duì)轉(zhuǎn)化效率進(jìn)行分析，并分析注射液濃度對(duì)原生質(zhì)體成活率的影響，結(jié)果表明注射液的濃度對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有重要影響，注射液濃度D600 nm 為0.3～0.7時(shí)均能得到理想的結(jié)果，在第4天至第6天時(shí)進(jìn)行檢測(cè)最為合適。在亞細(xì)胞定位研究中，利用 X-GFP-GUS 融合蛋白表達(dá)系統(tǒng)，其優(yōu)點(diǎn)是在檢測(cè)目標(biāo)蛋白的表達(dá)時(shí)，既可以通過GUS染色的方法觀察目的基因在植物不同組織和不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)情況，也可以直接通過顯微觀察細(xì)胞中的GFP熒光信號(hào)分析目的基因的亞細(xì)胞定位和蛋白互作情況；且X-GFP-GUS融合蛋白分子量較大，可以防止融合蛋白自由擴(kuò)散，對(duì)于目的蛋白分子量較小的基因可以減少定位誤差[10]。

參考文獻(xiàn)：

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1.3.3注射法轉(zhuǎn)化注射前將煙草在日光燈下培養(yǎng)2～3 h，以便煙草氣孔張開而有利于注射。選擇煙草植株中部較大的2張葉片進(jìn)行注射，先用去掉針頭的注射器輕輕擦除無主脈處的下表皮蠟質(zhì)，形成注射點(diǎn)；用無針頭的注射器吸取0.5～1.0 mL的菌體注射液，左手扶著注射葉片正面，右手將菌體注射液由注射點(diǎn)輕輕地推入，每個(gè)點(diǎn)注射量以注射液無法在葉背面擴(kuò)散為止，每個(gè)葉片注射不超過4個(gè)點(diǎn)，每個(gè)濃度的注射液注射5個(gè)植株。注射后，用標(biāo)記筆標(biāo)記注射液擴(kuò)散的范圍。為了防止操作失誤引起的注射液噴射，在注射的過程中要帶口罩、手套和眼鏡。如果同時(shí)進(jìn)行多個(gè)工程菌的注射，在注射不同的菌前更換1次手套，防止交叉污染。注射完后，將煙草放置于培養(yǎng)箱中，如果天氣晴朗，也可直接置于大棚內(nèi)培養(yǎng)，隔天澆1次水。

1.4顯微觀察目標(biāo)蛋白表達(dá)情況

由于pCAMBIA1304表達(dá)的為GUS-GFP融合基因，因此可以通過GUS染色和熒光顯微觀察2種途徑進(jìn)行目的蛋白表達(dá)的檢測(cè)。本研究通過熒光顯微觀察方法進(jìn)行GFP蛋白表達(dá)的檢測(cè)。（1）直接觀察法。注射后第2天開始，每天撕取一小片（1 cm2左右）的注射液擴(kuò)散范圍的煙草下表皮，放在載玻片上（滴水），蓋上蓋玻片，用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，連續(xù)觀察7 d，檢測(cè)陽性細(xì)胞的比例。（2）原生質(zhì)體觀察法。轉(zhuǎn)化后第4天，收集各個(gè)菌液濃度處理的3個(gè)植株葉片，每個(gè)植株取1.5 cm2左右，混樣提取原生質(zhì)體。原生質(zhì)體提取參照RAO等的方法[7]，先根據(jù)樣品配制提取溶液Ⅰ（每份樣品5 mL），將提取酶液溶液Ⅰ在55 ℃下溫育10 min，冷卻后加入提取溶液Ⅱ（每份樣品110 μL）；將葉片切成1 mm寬的細(xì)條，放入酶液Ⅰ和酶液Ⅱ的混合液中，用鑷子打散；抽真空 20 min 后消化3 h，搖勻，在裂解液中加入W5溶液稀釋（每份樣品5 mL），用300目鋼網(wǎng)過濾雜質(zhì)和碎片。將濾液吸入 2 mL 離心管中，100 g離心2 min后小心將離心管置于冰上15 min，去上清，加入MMG溶液調(diào)整各個(gè)樣品的原生質(zhì)體濃度至基本一致，約100 萬個(gè)/mL。用熒光顯微鏡進(jìn)行檢測(cè)各個(gè)樣品的陽性細(xì)胞比例，統(tǒng)計(jì)3個(gè)10倍鏡視野下的陽性細(xì)胞占正常原生質(zhì)體的比例，在明場(chǎng)下檢測(cè)完整原生質(zhì)體占視野中總原生質(zhì)體的比例，以未注射的煙草作為以上2個(gè)觀察試驗(yàn)的空白對(duì)照。

2結(jié)果與分析

2.1轉(zhuǎn)化煙草下表皮觀察

轉(zhuǎn)化后第2天開始，每天撕取不同濃度菌液注射后的煙草植株葉片的下表皮用熒光顯微觀察GFP的表達(dá)情況，由表1可見，除了D600 nm 為0.1的注射樣品外，在注射后第3天均可在煙草葉片下表皮中觀察到綠色熒光，而注射濃度D600 nm為0.3～07之間的注射樣品在第4天和第7天均可檢測(cè)到較強(qiáng)的綠色熒光。菌液濃度D600 nm>0.9時(shí)會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率；注射液D600 nm為0.5時(shí)，GFP的表達(dá)強(qiáng)度在第4天至第6天最好。

2.2菌液注射濃度對(duì)轉(zhuǎn)化效率和原生質(zhì)體成活率的影響

轉(zhuǎn)化后第4天，提取不同濃度菌液注射后的煙草葉片原生質(zhì)體進(jìn)行觀察，對(duì)GFP陽性細(xì)胞的比率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并在明場(chǎng)下統(tǒng)計(jì)破損原生質(zhì)體的比例，結(jié)果如圖2所示。當(dāng)D600 nm為0.1或大于0.9時(shí)，陽性細(xì)胞的檢出率均低于20%；而在0.3～07 之間時(shí)，陽性細(xì)胞檢出率均在30%以上；0.5則為最佳轉(zhuǎn)化濃度，轉(zhuǎn)化率達(dá)45%，原生質(zhì)體較為完整，轉(zhuǎn)化效率較高。隨著注射濃度的增加，菌液對(duì)葉片細(xì)胞的傷害增強(qiáng)，當(dāng)D600 nm>0.9時(shí)，提取的原生質(zhì)體成活率降低至60%以下。圖3為轉(zhuǎn)化后第4天注射菌液濃度D600 nm為0.5時(shí)注射區(qū)域煙草下表皮和原生質(zhì)體中GFP的表達(dá)情況。

3結(jié)論

農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化煙草的瞬時(shí)表達(dá)常常通過離體滲透法，也可通過注射法進(jìn)行[8-9]。本研究所用的農(nóng)桿菌滲透轉(zhuǎn)化法在轉(zhuǎn)化過程中只需配制菌體培養(yǎng)液和注射液，注射液現(xiàn)配現(xiàn)用，比較方便快捷。通過熒光顯微鏡在細(xì)胞水平對(duì)轉(zhuǎn)化效率進(jìn)行分析，并分析注射液濃度對(duì)原生質(zhì)體成活率的影響，結(jié)果表明注射液的濃度對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有重要影響，注射液濃度D600 nm 為0.3～0.7時(shí)均能得到理想的結(jié)果，在第4天至第6天時(shí)進(jìn)行檢測(cè)最為合適。在亞細(xì)胞定位研究中，利用 X-GFP-GUS 融合蛋白表達(dá)系統(tǒng)，其優(yōu)點(diǎn)是在檢測(cè)目標(biāo)蛋白的表達(dá)時(shí)，既可以通過GUS染色的方法觀察目的基因在植物不同組織和不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)情況，也可以直接通過顯微觀察細(xì)胞中的GFP熒光信號(hào)分析目的基因的亞細(xì)胞定位和蛋白互作情況；且X-GFP-GUS融合蛋白分子量較大，可以防止融合蛋白自由擴(kuò)散，對(duì)于目的蛋白分子量較小的基因可以減少定位誤差[10]。

參考文獻(xiàn)：

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