黃芪對大鼠腎臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其對細(xì)胞凋亡影響的研究

郭保偉 付剛 劉艷梅 邱道顯 馬志鵬

細(xì)胞凋亡在臨床上十分常見, 譬如器官移植排斥反應(yīng)及器官缺血再灌注損傷都存在細(xì)胞凋亡。黃芪對心、腦缺血再灌注損傷具有一定保護(hù)作用, 但對腎缺血再灌注損傷是否具有保護(hù)作用及其凋亡影響的研究報(bào)道較少。本研究目的是觀察黃芪注射液對腎臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其對細(xì)胞凋亡影響, 探討其可能機(jī)制, 為臨床應(yīng)用黃芪防治腎臟缺血再灌注損傷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 健康清潔級SD大鼠30只, 體質(zhì)量(240±10)g,購自青島市動物實(shí)驗(yàn)中心。

1.2 藥品與試劑 尿素氮、肌酐、丙二醛、超氧化物歧化酶試劑盒均購自上海生物研究所, 黃芪注射液由成都地奧九泓制藥廠生產(chǎn), 原位細(xì)胞凋亡(TUNEL)試劑盒、SP二抗免疫組化試劑盒購自武漢博士得生物工程有限公司。

1.3 方法 模型制備將SD大鼠術(shù)前飼養(yǎng)1周, 手術(shù)前禁食6 h, 將實(shí)驗(yàn)動物隨機(jī)分為三組(n=10), A組為缺血再灌注組,B組為黃芪治療組, C 組為正常對照組。A組從門靜脈注入NS1.2 ml/100 g, 10 min后夾閉腎動脈, 當(dāng)阻斷45 min后去除腎動脈夾再灌注, 肉眼觀察腎臟由暗紅色變?yōu)轷r紅色, 說明腎臟再灌注成功, 縫合切口, 24 h后采血；B組用黃芪針劑1.2 ml/100 g代替NS, 其余處理同再灌注組；C組從門靜脈注入NS 1.2 ml/100 g, 但不夾閉腎動脈, 等暴露45 min后縫合切口。切口縫合后繼續(xù)喂養(yǎng)24 h, 自由攝水, 進(jìn)食。24 h后麻醉取血液標(biāo)本, 行有關(guān)酶學(xué)和生化指標(biāo)檢測。切除大鼠腎臟, 用4%低聚甲醛溶液固定, 石蠟包埋并編號, 待做病理學(xué)檢查。

1.4 檢測指標(biāo)及方法

1.4.1 血清BUN、Cr、SOD、MDA測定 采集各組的血液標(biāo)本, 用生化分析儀測定各組血肌肝、尿素氮含量。血漿中的SOD測定用黃嘌呤氧化酶法, 血漿中的MDA測定用試劑盒說明書操作。

1.4.2 腎組織切片制備 將用4%低聚甲醛溶液固定, 石蠟包埋并編號的標(biāo)本, 4 μm厚連續(xù)切片, 行HE染色觀察。

1.4.3 凋亡指數(shù)的檢測 利用TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡指數(shù), 凋亡細(xì)胞鏡下胞體縮小, 核膜皺縮, 染色不均勻, 細(xì)胞核中有棕黃色顆粒, 可見核固縮及核碎裂。每張切片在400倍鏡下觀察10個連續(xù)不重疊視野, 計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù), 凋亡指數(shù)=(凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))×100%。

1.4.4 Bcl-2蛋白表達(dá) 用免疫組化SABC法測定Bcl-2蛋白表達(dá)。Bcl-2陽性表達(dá)為胞漿染色呈棕黃色, 而Bax蛋白陽性表達(dá)表現(xiàn)為胞漿染色黃褐色, 每張切片在400倍鏡下觀察10個連續(xù)不重疊視野, 后用HPIAS-1000高清晰彩色病理圖像免疫組化軟件分析其平均灰度值, 可視為Bcl-2或Bax的相對含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0軟件統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示, 采用t檢驗(yàn), 計(jì)數(shù)資料采用χ2分析, P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血BUN、Cr、SOD、MDA的測定結(jié)果 A組與C組比較, 前者術(shù)后BUN、Cr水平明顯高于后者, 二者比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), B組與A組比較, 后者較前者術(shù)后BUN、Cr水平顯著下降, 二者比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。A組和B組血漿SOD均顯著低于C組(P<0.05), 而MDA水平顯著高于C組(P<0.05), B組血漿SOD顯著高于A組(P<0.05), 而MDA顯著性低于A組(P<0.05), 具體見表1。

2.2 腎臟組織病理 ①光鏡下病理變化：正常對照組腎小管結(jié)構(gòu)基本正常, 腎小管上皮細(xì)胞無變性壞死, 腔內(nèi)未發(fā)現(xiàn)管型。黃芪治療組腎小管上皮細(xì)胞腫脹明顯, 空泡可見變性,腎小管上皮細(xì)胞局部見到壞死脫落, 間質(zhì)可見出血。缺血再灌注組腎皮質(zhì)腎小管壞死廣泛, 腎間質(zhì)局部出血、水腫, 并見蛋白管型, 可見到腎小管輪廓, 腎小球結(jié)構(gòu)基本完整。比較而言, 黃芪治療組與缺血再灌注組比較, 病理改變明顯減輕。②腎小管細(xì)胞凋亡指數(shù)變化：在光學(xué)顯微鏡下, 凋亡細(xì)胞的胞核中有棕黃色顆粒, 可見核固縮及核碎裂。以遠(yuǎn)端腎小管上皮細(xì)胞多見, 近曲腎小管上皮細(xì)胞和間質(zhì)少見, 腎小球未見到凋亡細(xì)胞。治療組凋亡指數(shù)明顯低于缺血再灌注組(P<0.05)。③Bcl-2及Bax蛋白表達(dá)情況：結(jié)果表明Bcl-2及Bax蛋白表達(dá)以腎小管上皮細(xì)胞為主, A組與C組比較, Bax表達(dá)顯著增強(qiáng), 二者比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01), 而Bcl-2表達(dá)略增強(qiáng)(P<0.05), Bcl-2/ Bax比值明顯下降, 二者比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；B組與A組比較, Bax表達(dá)下降明顯, 二者比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), Bcl-2表達(dá)明顯增強(qiáng), 二者比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01), Bcl-2/Bax比值升高, 二者比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01), AI顯著低于A組(P<0.05)。具體見表2。

表1 血BUN、Cr、SOD、MDA的測定結(jié)果(±s)

表1 血BUN、Cr、SOD、MDA的測定結(jié)果(±s)

注：a, 與C組比較, P<0.05；b, 與A組比較, P<0.05；c, 與C組比較, P<0.05；d, 與A組比較, P<0.05

組別 例數(shù) BUN(mmol/L)Cr(μmol/L)SOD(U/ml)MDA(μmol/ml)A 10 14.25±2.13a 276.67±3.18a 170.45±14.27c 8.998±0.345c 10 9.40±2.60b 100.42±4.02b 241.69±19.00cd 6.206±0.599cd C 10 7.21±3.31 75.93±5.24 335.63±14.688 4.560±0.235 B

表2 各組Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)情況及凋亡指數(shù)的比較(±s)

表2 各組Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)情況及凋亡指數(shù)的比較(±s)

注：與C組比較, a, P<0.01, b, P<0.05；與A組比較, c, P<0.05, d, P<0.01

10 0.1430±0.02b 0.2029±0.03a 0.70±0.06a 28.5±4.4 B 10 0.2643±0.02d 0.1589±0.03c 1.65±0.15d 15.6±3.5c C 10 0.1125±0.05 0.1038±0.03 1.07±0.04 3.10±2.2組別 例數(shù) Bcl-2 Bax Bcl-2/Bax AI A

3 討論

藥理學(xué)研究表明黃芪具有補(bǔ)氣升陽、扶正祛邪、抗毒排膿、益氣利水等功效, 從西醫(yī)角度上講即具有抗炎、利尿、強(qiáng)心及促進(jìn)免疫等多種作用, 近年來有研究發(fā)現(xiàn)黃芪還能降低自由基生成和增加自由基的清除作用［1,2］。研究表明黃芪的活性成分可以清除自由基, 預(yù)防生物膜的脂質(zhì)過氧化［3］。本實(shí)驗(yàn)用黃芪注射液干預(yù)下, 黃芪治療組與缺血再灌注組比較, SOD活性和MDA含量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 提示該藥具有保護(hù)SOD的活性, 減輕脂質(zhì)過氧化損傷, 從而對腎臟缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用, 這與國內(nèi)楊岳等［4］報(bào)道相一致。細(xì)胞凋亡不同于細(xì)胞壞死, 前者是由特定的基因調(diào)控實(shí)現(xiàn)的, 是維持機(jī)體自身穩(wěn)定的重要機(jī)制之一。細(xì)胞凋亡可參與缺血再灌注損傷, 但確切機(jī)制仍未闡明。Bcl-2家族是目前最受重視的凋亡相關(guān)基因家族。Bcl-2可阻止細(xì)胞凋亡, Bax可促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究通過對凋亡調(diào)控基因Bcl-2和Bax的檢測發(fā)現(xiàn), 正常情況下, 在腎小球和腎小管區(qū)Bax表達(dá)較弱, 而Bcl-2在腎小管區(qū)表達(dá)較強(qiáng), 在總體上這兩類基因處于相對平衡狀態(tài)。當(dāng)應(yīng)用黃芪治療后, 觀察到Bax的表達(dá)明顯下調(diào), 而Bcl-2基因表達(dá)顯著增強(qiáng), 細(xì)胞凋亡明顯減輕, 腎小管細(xì)胞得到保護(hù), 這與張春軍等［5］研究結(jié)果相吻合。通過凋亡指數(shù)的測定發(fā)現(xiàn)：黃芪治療組和缺血再灌注組腎臟細(xì)胞凋亡指數(shù)與對照組相比較顯著升高, 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01), 黃芪治療組腎臟細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著低于缺血再灌注組(P<0.05), 因此認(rèn)為黃芪對腎臟缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用, 其機(jī)制可能部分是通過調(diào)節(jié)凋亡調(diào)控基因Bcl-2和Bax的表達(dá)來降低細(xì)胞凋亡指數(shù)實(shí)現(xiàn)的。

［1］張金國, 高東升, 魏廣和, 等.黃芪注射液對急性心肌梗死早期患者左室重塑及心功能的影響.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志, 2002,22(5):346-348.

［2］蘇群, 方強(qiáng).黃芪與牛磺酸對急性病毒性心肌炎患者血脂質(zhì)過氧化物的影響.浙江預(yù)防醫(yī)學(xué), 2001, 13(6):9-10.

［3］許靜, 秦小紅, 薛梅.黃芪對D-半乳糖衰老大鼠脂質(zhì)過氧化及紅細(xì)胞免疫功能的影響.江蘇醫(yī)藥, 2007, 33(6):596-597.

［4］楊岳, 謝席勝, 艾娜, 等.黃芪三七合劑對大鼠腎缺血再灌注損傷的作用及機(jī)制研究.華西醫(yī)學(xué), 2013, 28(4):500-504.

［5］張春軍, 董琦, 董凱, 等.黃芪對大鼠腦缺血再灌注損傷c-fos和Bcl-2表達(dá)及細(xì)胞凋亡的影響.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2011,28(4):425-427.