紅細胞洗滌前后血紅蛋白電泳結果的比較

劉發(fā)生，夏志楊，盛翔，周燦邦

(東莞仁康醫(yī)院檢驗科，廣東 東莞523952)

電泳分析是研究和分離異常血紅蛋白的有效方法，是診斷血紅蛋白分子病不可缺少的手段。血紅蛋白電泳作為地中海貧血篩查項目，在日常工作中標本多，而紅細胞洗滌為手工操作，不僅工作量大，而且產(chǎn)生大量需要消毒的實驗廢液。為了減輕工作量，我們以洗滌前后的紅細胞分別制備血紅蛋白液，同時進行血紅蛋白電泳；還以血漿代替紅細胞加等量溶血劑后在血紅蛋白電泳凝膠上電泳，觀察是否出現(xiàn)電泳區(qū)帶，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 標本來源 收集本院2013年1月11日至2013年3月16日期間，地中海貧血篩查乙二胺四乙酸二鉀抗凝血標本259份，其中靜脈血121份(男性10人，年齡14～43歲，平均31.6歲；女性111人，年齡16～82歲，平均27.4歲)，臍帶血 138份。收集乙二胺四乙酸二鉀抗凝的無溶血血漿26份，其中靜脈血漿13份(總蛋白59.9～93.9g/L、白蛋白33.5～58.2g/L、 球蛋白 25.8～65.0g/L)， 臍帶血漿 13份(總蛋白 48.1～64.8g/L、白蛋白 27.3～38.7g/L、球蛋白13.3～31.7g/L)。不能當天電泳的標本置4℃冰箱冷藏保存，時間不超過1周。

1.2 儀器與試劑 Interlab G26全自動蛋白質電泳儀，由意大利Interlab公司生產(chǎn)，使用該公司配套生產(chǎn)的堿性血紅蛋白凝膠電泳試劑盒604K。嚴格按儀器和試劑說明書操作。

1.3 方法

1.3.1 洗滌前紅細胞血紅蛋白電泳 抗凝血標本經(jīng)3500r/min 10min后，傾去血漿和上層紅細胞，留取管底層紅細胞，吸取管底層紅細胞50μl，加入450μl溶血劑中，混勻，靜置5min后加樣上機進行血紅蛋白電泳。

1.3.2 洗滌后紅細胞血紅蛋白電泳 將上述管底層紅細胞加2 ml生理鹽水，混勻后3500r/min 5min，吸去上清液后再加2 ml生理鹽水，如此洗3次。吸取管底層紅細胞50μl，加入450μl溶血劑中，混勻，靜置5min后加樣上機進行血紅蛋白電泳。

1.3.3 血漿代替紅細胞電泳 取血漿50μl，加入450μl溶血劑中，混勻，靜置5min后加樣上機在血紅蛋白瓊脂糖凝膠上電泳。

1.4 統(tǒng)計學方法 以SPSS 15.0軟件進行配對t檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 121份靜脈血標本血紅蛋白電泳結果 (1)紅細胞洗滌前后電泳圖目視檢查，區(qū)帶數(shù)和位置完全一致，HbA與HbA2光度密掃描結果的統(tǒng)計學分析見表1；配對t檢驗，P均＞0.05，說明靜脈血紅細胞洗滌前后電泳結果的差異沒有統(tǒng)計學意義。(2)有3份標本紅細胞洗滌前檢出HbF(分別為1.0%、0.4%、0.7%)，而洗滌后HbF均為0；另有1份標本洗滌前HbF 9.8%，洗滌后HbF 9.4%。也即，少數(shù)靜脈血標本未洗滌紅細胞對HbF結果可能有一定影響(≤1.0%)，但不影響結果的定性判斷。(3)有1份標本檢出“快泳帶”，洗滌前42.6%，洗滌后41.3%。

表1 121份靜脈血紅細胞洗滌前后血紅蛋白電泳結果

2.2 184份臍帶血標本血紅蛋白電泳結果 (1)紅細胞洗滌前后電泳圖目視檢查，區(qū)帶數(shù)和位置完全一致，HbA與HbF光度密掃描結果的統(tǒng)計學分析見表2；(2)有17份標本洗滌前和/或洗滌后檢出HbA2，結果統(tǒng)計分析見表3；(3)有11份標本檢出“快泳帶”，結果統(tǒng)計分析見表4?？梢姡瑹o論是HbA、HbF，還是 HbA2或者“快泳帶”的配對 t檢驗，P＞0.05，說明臍帶血紅細胞洗滌前后電泳結果的差異沒有統(tǒng)計學意義。

表2 184份臍帶血紅細胞洗滌前后血紅蛋白電泳結果

表3 17份臍帶血檢出HbA2情況

表4 11份臍帶血檢出快泳帶情況

2.3 血漿代替紅細胞電泳結果13份成人血漿和13份臍帶血漿電泳圖目視檢查，在掃描區(qū)域內均未發(fā)現(xiàn)任何區(qū)帶，只在陽極海綿條位置有一染色區(qū)帶?？梢姡♂?0倍的血漿在血紅蛋白電泳條件下的電泳圖于掃描區(qū)域內不會呈現(xiàn)區(qū)帶。

2.4 部分標本紅細胞洗滌前后的血紅蛋白電泳圖與血漿代替紅細胞的電泳圖 見圖1。

圖1 部分標本紅細胞洗滌前后的血紅蛋白電泳圖與血漿代替紅細胞的電泳圖

3 討論

地中海貧血的診斷遵循由篩查試驗(血液學表型分析)到確診試驗(基因型分析)的流程。目前一般把全血細胞計數(shù)、血紅蛋白電泳作為地中海貧血的初篩指標[1]。與紅細胞參數(shù)、滲透脆性等地貧篩查方法相比，血紅蛋白電泳不僅可以檢測HbA、HbF及HhA2含量，將地中海貧血初步分類為α地貧或β地貧，還可篩查出各種異常血紅蛋白，如HbBatr`s、HbH、HbE、HbJ、HbG、HbD、HbK、HbCS等，有助于臨床確診，為進一步進行基因診斷和遺傳咨詢提供基礎[2，3]。

瓊脂糖凝膠結構均勻，含水量大，近似自由電泳，且對樣品吸附極微。因此，電泳圖譜清晰，分辨率高，重復性好[4]。全自動瓊脂糖凝膠電泳具有能嚴格控制電泳條件，自動掃描定量，避免人工操作帶來的技術誤差，保證各區(qū)帶定量的準確性，圖譜可長期保存等優(yōu)點，目前被很多醫(yī)院用于地中海貧血的篩查，但有報道，其對部分HbH及HbBatr`s區(qū)帶不能準確檢出[5]。

血紅蛋白液的制備方法有四氯化碳法、氯仿法、蒸餾水法等。四氯化碳法制備的血紅蛋白液清晰、穩(wěn)定，但毒性較大。氯仿雖然毒性較小，但能沉淀不穩(wěn)定血紅蛋白而不能用于不穩(wěn)定血紅蛋白的檢查。蒸餾水法簡便易行，為多數(shù)全自動電泳儀試劑盒所采用，本研究用試劑盒也為蒸餾水法，但因未除去膜蛋白，判斷結果時應注意，且制成的血紅蛋白液不能保存[6]，還有報道，蒸餾水法對異常血紅蛋白的檢出率不如四氯化碳法[7]。

為了避免血漿蛋白對血紅蛋白電泳結果的影響，一般都要對紅細胞進行洗滌。但是，紅細胞洗滌為手工勞動，操作繁瑣，費時費力，而且產(chǎn)生大量需要消毒處理的廢液。本研究結果表明：即使以血漿代替紅細胞進行電泳，在實驗條件下也不會出現(xiàn)電泳區(qū)帶。因為血紅蛋白電泳時間較血清蛋白電泳時間長，血漿蛋白都“跑”過了血紅蛋白電泳圖的掃描區(qū)域。而且，離心后管底紅細胞層中血漿量很少，其點樣液中的血漿蛋白組分濃度達不到瓊脂糖凝膠電泳的檢測限(0.54g/L)[8]，因而在血紅蛋白電泳圖掃描區(qū)域內看不到血漿蛋白區(qū)帶，紅細胞洗滌前后血紅蛋白電泳各區(qū)帶掃描結果的差異也沒有統(tǒng)計學意義。因此，我們認為全血3500r/min 10min離心后管底紅細胞無需洗滌，可直接制備血紅蛋白液用于Interlab G26瓊脂糖凝膠電泳。

盡管未洗滌紅細胞與洗滌紅細胞的血紅蛋白電泳結果定性判斷一致，但少數(shù)靜脈血標本未洗滌紅細胞對HbF結果可能有一定影響，是否有某些特殊病例的血漿成分會出現(xiàn)異常區(qū)帶或與血紅蛋白區(qū)帶重疊，有待進一步觀察。因此，對于出現(xiàn)存疑區(qū)帶的標本，或臨床與其他實驗提示可能有異常血紅蛋白的標本，應當在洗滌紅細胞后，以四氯化碳法制備血紅蛋白液進行電泳復檢。

[1]高麗韶,王瑩,張翠梅.認識地中海貧血(上)[M].廣州：廣東人民出版社,2010:99-100.

[2]陳忠領,魏新燕,范關珍,等.911例血紅蛋白電泳結果分析[J].實用醫(yī)技雜志,2006,13(16):2806-2807.

[3]梁廷中.全自動血紅蛋白電泳在地中海貧血篩查中的作用[J].實驗與檢驗醫(yī)學,2011,29(4):417-418.

[4]康熙雄.臨床電泳[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2006:29-30.

[5]陳永秀,周云珍,陳錦宏,等.兩種電泳方法血紅蛋白分析一致性的比較[J].檢驗醫(yī)學，2013,28(3):229-232.

[6]葉應嫵,王毓三,申子瑜.全國臨床檢驗操作規(guī)程[M].第3版.南京:東南大學出版社,2006:180.

[7]劉慶峰,何雅軍,黎慶梅,等.兩種不同溶血方法對Hb電泳分辨率的影響[J].臨床醫(yī)學工程,2010,17(1):37-38.

[8]Interlab Srl.Alkaline Hemoglobin Electrophoresis procedure for Microgel and Interlab G26[EB/CD].Roma:Interlab Srl,2008,10:9.