食品衛(wèi)生檢驗(yàn)中沙門菌屬LAMP檢測(cè)方法的應(yīng)用效果評(píng)價(jià)

周建亮，萬(wàn)艷芳

(1、東鄉(xiāng)縣疾病預(yù)防控制中心檢驗(yàn)科，江西 東鄉(xiāng)331800；2、東鄉(xiāng)縣人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西 東鄉(xiāng)331800)

沙門菌屬屬于細(xì)菌性食物中毒的主要誘發(fā)病原體之一，因此對(duì)于食品沙門菌的快速敏感衛(wèi)生檢測(cè)十分重要[1]。目前，國(guó)內(nèi)多采用分離培養(yǎng)法進(jìn)行食品沙門菌檢測(cè)，但操作步驟較多，繁瑣且費(fèi)時(shí)。而其他的諸如免疫學(xué)方法、各種聚合酶鏈反應(yīng)法，要么敏感度較差，要么各種聚合酶鏈反應(yīng)需要特殊儀器設(shè)備，應(yīng)用具有一定局限性。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù)作為新型等溫核酸擴(kuò)增方法，操作簡(jiǎn)單，敏感度較高。現(xiàn)對(duì)食品衛(wèi)生檢驗(yàn)中沙門菌屬LAMP檢測(cè)方法與分離培養(yǎng)法檢測(cè)效果進(jìn)行比較研究，報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013年3月至9月收集的127份食品樣本作為研究對(duì)象。其中生鮮肉21份，熟肉制品20份，生水產(chǎn)品20份，非發(fā)酵豆制品17份，冷凍生肉16份，速凍米面制品12份，冰激凌9份，鮮榨果汁6份，生食類蔬菜6份。參考菌株為腸炎沙門菌(ATCC，DSM-14221)。

1.2 方法 參照 《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)沙門氏菌檢驗(yàn)》標(biāo)準(zhǔn)對(duì)收集的127分樣本進(jìn)行增菌培養(yǎng)。所有樣本均取樣25g加入至裝有BPW 225ml的無(wú)菌均質(zhì)袋中使用拍擊式均質(zhì)器連續(xù)拍打1～2 min，然后將樣本放入37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)8～18h。冷凍產(chǎn)品需在45℃以下15min內(nèi)解凍。取培養(yǎng)過(guò)的食品樣本進(jìn)行LAMP檢測(cè)和分離培養(yǎng)鑒定，兩種檢測(cè)方法具體如下。LAMP檢測(cè)：分別取1ml食品標(biāo)本前增菌液在10000r/min下離心2min，棄上清，提取核酸；再取1μl上清液，作為待檢模板DNA。參考中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部GB 4789.4-2010食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中的《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)沙門氏菌檢驗(yàn)》進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，然后對(duì)食品標(biāo)本增菌液DNA進(jìn)行檢測(cè)[2]。 反應(yīng)體系(25μl)：40μM FIP 1.0μl，40μM BIP 1.0μl，10μM F3 0.5μl，10μM B3 0.5μl，Buffer 2.5μl，10 mM dNTP 3.5μl，5M Betaine 5.0μl，250mM MgSO40.6 μl，Bst DNA 聚合酶 1.0μl，DNA模板 2μl，加 ddH2O 至反應(yīng)體系為 25μl。65℃水浴60min，80℃滅活酶終止反應(yīng)體系。反應(yīng)結(jié)束后，肉眼檢測(cè)，以明顯渾濁為陽(yáng)性，以未出現(xiàn)渾濁為陰性。分類培養(yǎng)鑒定：參考中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部GB 4789.4-2010食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中的 《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)沙門氏菌檢驗(yàn)》進(jìn)行操作，首先將培養(yǎng)過(guò)的食品標(biāo)本前增菌液搖動(dòng)后取1ml轉(zhuǎn)于10mlTTB增菌液內(nèi)，42℃培養(yǎng)過(guò)夜。另取1ml轉(zhuǎn)種于10mlSC增菌液內(nèi)，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。分別取食品標(biāo)本的增菌液1環(huán)劃線接種于BS平板和XLD平板，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。取3個(gè)可疑菌落接種在TSI、賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基以及營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。對(duì)于具備沙門菌特征的菌落，可制備菌懸液，通過(guò)全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)鑒定。如無(wú)沙門菌特征，則可繼續(xù)培養(yǎng)過(guò)夜，無(wú)菌落則表明為沙門菌陰性。瓊脂糖凝膠電泳：取擴(kuò)增產(chǎn)物5μl，1%～2%的瓊脂糖凝膠電泳，分析LAMP特征性電泳圖譜。比較兩種方法檢測(cè)陽(yáng)性率。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 所有數(shù)據(jù)均使用 SPSS17.0數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，采用χ2檢驗(yàn)，α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，以P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

127 份食品樣本沙門菌LAMP檢測(cè)陽(yáng)性14份，陽(yáng)性率為11.02%；分離培養(yǎng)法檢測(cè)陽(yáng)性6份，陽(yáng)性率為4.72%，分別為鼠傷寒沙門菌，豬霍亂沙門菌，腸炎沙門菌。LAMP檢測(cè)陽(yáng)性率明顯高于分離培養(yǎng)法，差異具有顯著性，P＜0.05。見表1。

表1 127份樣本檢測(cè)結(jié)果

電泳檢測(cè)結(jié)果顯示凝膠瓊脂糖電泳出現(xiàn)最小片段＞100 bp的LAMP特征性梯狀條帶為陽(yáng)性。見圖1。

圖1 沙門菌LAMP擴(kuò)增電泳圖

各樣本LAMP法檢測(cè)時(shí)間均在24h內(nèi)，分離培養(yǎng)法檢測(cè)時(shí)間在4～7d。兩種檢測(cè)結(jié)果皆為陽(yáng)性的樣本為5份，兩種檢測(cè)結(jié)果皆為陰性的樣本為112份。

3 討論

LAMP即環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法，是一種新型的核酸擴(kuò)增方法，其特點(diǎn)是針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4種特異引物，在鏈置換DNA聚合酶(Bst DNA polymerasc)的作用下，65℃恒溫?cái)U(kuò)增。其操作簡(jiǎn)單，有強(qiáng)的特異性，擴(kuò)增產(chǎn)物易檢測(cè)，在食品微生物檢驗(yàn)中有廣泛的應(yīng)用前景[3]。對(duì)于其結(jié)果，通過(guò)肉眼觀察白色渾濁沉淀就可以判定擴(kuò)增與否。本文研究中，通過(guò)肉眼觀察渾濁確定陽(yáng)性結(jié)果，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。本研究采用分離培養(yǎng)法和LAMP法檢測(cè)食品樣本中的沙門菌屬，其中分離培養(yǎng)法參照《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)沙門氏菌檢驗(yàn)》標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行前增菌、增菌、分離、篩選可疑菌落、生化及血清學(xué)鑒定等幾個(gè)必要步驟，一般4d可得到陰性檢測(cè)結(jié)果，需要7d左右可得到沙門菌檢測(cè)結(jié)果[4]。同時(shí)，該方法生化鑒定過(guò)程繁瑣，需要以全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)作為基礎(chǔ)，血清分型效價(jià)低、試劑昂貴且易失效。相比于需要兩次增菌后才能分離培養(yǎng)的分離培養(yǎng)法，LAMP法僅需進(jìn)行前增菌液核酸提取即可進(jìn)行擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)，1h內(nèi)即可完成擴(kuò)增過(guò)程，省略了大量繁瑣步驟，24h內(nèi)即可完成檢測(cè)樣本中沙門菌的任務(wù)，速度快捷[5]。另外，LAMP法能夠用肉眼直接判斷結(jié)果[6]，更加直觀和可靠，在應(yīng)對(duì)食物中毒的快速檢測(cè)上具有良好的應(yīng)用前景。

本研究中對(duì)分離培養(yǎng)法和LAMP法檢測(cè)效果進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示LAMP法檢出率更高，但其不能夠進(jìn)一步鑒定分型和分離菌株，需要與分離培養(yǎng)法配合檢測(cè)。

總體來(lái)看，LAMP法檢測(cè)食品中沙門菌屬陽(yáng)性率較高，檢測(cè)時(shí)間短，與分離培養(yǎng)法配合檢測(cè)能夠有效提高食品衛(wèi)生檢驗(yàn)的準(zhǔn)確性和效率，應(yīng)用和推廣價(jià)值較高。

[1]郭仲輝,陳冬雅,黎毓光,等.沙門菌的檢測(cè)及耐藥性分析[J].實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),2013,31(01):63-64.

[2]GB 4789.4-2010.食品微生物學(xué)檢驗(yàn)沙門氏菌檢驗(yàn)[S].2010.

[3]Parker CT,Huynh S,Quinones B,et al.Comparison of genotypes of Salmonella enterica serovar Enteritidis phage type 30 and 9c strains isolated during three outbreaks associated with raw almonds[J].Appl Environ Microbiol,2010,76(11):3723-3731.

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[5]葉文,楊柳青,張如勝,等.沙門菌屬LAMP檢測(cè)方法在食品衛(wèi)生檢驗(yàn)中的應(yīng)用評(píng)價(jià)[J].中華疾病控制雜志,2011,15(09):785-787.

[6]張宏偉,葉露萌,彭?xiàng)钏?等.利用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)對(duì)沙門氏菌進(jìn)行檢測(cè)[J].食品研究與開發(fā),2009,30(05):115-118.