肺鱗癌及腺癌中NGAL表達(dá)的免疫組化研究

王彩紋，劉翼軍，熊國亮，余少良

(江西省胸科醫(yī)院，江西 南昌330006)

中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL) 是lipocalin家族的一個成員，在中幼粒細(xì)胞和晚幼粒細(xì)胞分化階段合成，其功能尚不清楚[1]。以前的研究顯示NGAL可能參與多樣的生化過程，涉及胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化、炎癥免疫應(yīng)答、細(xì)胞凋亡、脂質(zhì)代謝、腫瘤的發(fā)生發(fā)展等等[2]。因其在人類多種腫瘤及炎癥組織細(xì)胞中異常表達(dá)，且可能參與免疫炎癥反應(yīng)以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展，近年來已成為腫瘤相關(guān)研究領(lǐng)域的一個新熱點。本研究旨在通過免疫組化技術(shù)檢測NGAL在肺鱗癌及腺癌組織中的表達(dá)，探討NGAL在其臨床和病理診斷中可能的作用及意義。

1 材料與方法

1.1 一般資料 選擇2009年3月至2011年3月在江西省胸科醫(yī)院手術(shù)治療并獲得其目前轉(zhuǎn)移等情況資料的肺鱗癌35例及腺癌30例(男42例；女23例)作為實驗組，并取其中及相應(yīng)42例(男28女14)癌旁肺組織(遠(yuǎn)離腫瘤組織至少5cm，另23例因取材原因舍棄)為對照組，年齡23～72歲，中位年齡47歲；所有患者術(shù)前均未進(jìn)行放化療及內(nèi)分泌治療，據(jù)2008年WHO肺癌分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行組織學(xué)分類：鱗癌35例，腺癌30例，高分化5例，中分化51例，低分化6例。依據(jù)國際抗癌聯(lián)盟2009年修訂的肺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期：Ⅰ期16例，Ⅱ期26例，Ⅲ期23例；伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者31例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者34例。所有患者術(shù)前均未行化療、放療等輔助治療。以上標(biāo)本手術(shù)切取后立即置于液氮中保存?zhèn)溆茫溆嗖糠殖Ｒ?guī)送病理檢查。

1.2 試劑 鼠抗人NGAL單克隆抗體 (NGAL，sc－07，1∶200)， 購于美國圣克魯斯生物技術(shù)公司，(貨號sc-80234)，免疫組化SP法試劑盒及 DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法 68℃烤片20min后,常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水；3%H2O237℃孵育10min，PBS沖洗3次(每次不少于5min)；抗原修復(fù)后以羊血清工作液封閉，37℃孵育10min加一抗于4℃ 冰箱過夜，用PBS緩沖液代替一抗作陰性對照；滴加生物素標(biāo)記二抗,37℃孵育30min,PBS沖洗后滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素工作液；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，自來水充分沖洗后，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水，透明，干燥，封片。

1.4 結(jié)果判定 NGAL的表達(dá)以細(xì)胞漿有棕黃色著色為陽性，所有切片均由本院2位資深病理醫(yī)師采用雙盲法觀察切片，每張切片隨機(jī)選取4個高倍視野(×400)，各計數(shù)200個細(xì)胞。具體判斷標(biāo)準(zhǔn)為無色0分，淡黃色1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；另根據(jù)染色程度及陽性染色細(xì)胞數(shù)占腫瘤細(xì)胞總數(shù)的百分比來綜合計分，陰性為0分，陽性細(xì)胞率≤10%為1分，11%～50%為2分，＞50%為3分；將二者之乘積記為陽性標(biāo)記指數(shù)(label index，LI)，以此判斷表達(dá)強(qiáng)度，將LI分為四個等級，0～2 分視為陰性(-)，3～4 分為弱陽性(+)，5～6 分為中等陽性(++)，＞6 分為強(qiáng)陽性(+++)[3]。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件，各組間率比較采用χ2檢驗，分析 NGAL蛋白間關(guān)系采用Spearman等級相關(guān)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 在35例鱗癌、30例腺癌及相應(yīng)42例癌旁組織中，NGAL蛋白的陽性表達(dá)均呈棕色顆粒分布，其中在肺腺癌及鱗癌組織中陽性表達(dá)則主要表達(dá)于細(xì)胞漿，局部、灶性和彌漫性表達(dá)均有，腺癌中彌漫性表達(dá)比鱗癌相對較多；遠(yuǎn)癌肺組織中陽性表達(dá)則主要表達(dá)于細(xì)胞膜內(nèi)表面，極少細(xì)胞有彌散性表達(dá)(圖1)。陽性對照可見明顯胞漿陽性信號顯示，陰性對照則無陽性信號顯示。NGAL蛋白在30例肺腺癌中有14例呈強(qiáng)陽性表達(dá) (46.7%)，11例呈陽性表達(dá)(36.7%)，5例呈陰性表達(dá)(16.7%)；在35例鱗癌中有8例呈強(qiáng)陽性表達(dá)(22.9%)，13例呈陽性表達(dá) (37.1%)，14例NGAL蛋白呈弱陽性或陰性表達(dá) (40.0%)(表1)；而對照的42例癌旁組織中，僅12例呈陽性表達(dá)(28.6%)，NGAL蛋白在肺腺癌組織中的陽性表達(dá)率顯著高于鱗癌，其在肺鱗狀細(xì)胞癌組織中的陽性表達(dá)率又顯著高于其癌旁組織(P＜0.05)。

2.2 NGAL的表達(dá)在所查肺癌病例中，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的陽性表達(dá)率 (83.9%)高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(58.8%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.004)。且NGAL的陽性表達(dá)率隨著TNM分期的升高而升高，I期、II期、III期患者中分別為56.3%、69.2%、82.6%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.024)。其表達(dá)與患者性別、年齡、吸煙無關(guān)(P>0.05)(表1)。

圖1 肺腺癌、鱗癌及癌旁正常組織中NGAL蛋白的表達(dá)(SPх400)

3 討論

非小細(xì)胞肺癌是全球發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，其中約有80%為腺癌及鱗癌，近年來其發(fā)病率在我國呈上升和年輕化趨勢，其發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移均涉及極其復(fù)雜的多基因調(diào)控異常過程[3]。因此，研究肺癌的病因、發(fā)病機(jī)制具有重要的臨床意義。

Lipocalin家族均有著一個高度保守的由8條反向平行的折疊桶狀三級結(jié)構(gòu)，可與疏水性小分子結(jié)合，也可與某些細(xì)胞膜受體結(jié)合,NGAL作為Lipocalin家族的一員，在細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定或免疫調(diào)節(jié)中扮演重要角色，除中性粒細(xì)胞外，正常情況下，NGAL蛋白亦可在腔道表面組織細(xì)胞微量表達(dá)，如呼吸系統(tǒng)的肺泡間巨噬細(xì)胞、消化系統(tǒng)的胃壁細(xì)胞小腸部分潘氏細(xì)胞、肝膽管細(xì)胞、前列腺上皮細(xì)胞等。但在機(jī)體呈病理狀態(tài)時，其表達(dá)程度明顯上調(diào)，眾多學(xué)者認(rèn)為是因其在抗感染中發(fā)揮的重要作用而引起[4]，進(jìn)一步研究證實，NGAL蛋白還可能作為一種新的癌基因，在許多腫瘤中表達(dá)上調(diào)[5]。

本研究通過檢測NGAL蛋白在65例肺癌患者的癌組織及癌旁組織中的表達(dá)，探討其在肺鱗癌及腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中的作用，進(jìn)一步證實了NGAL作為一種癌基因的可能性。并探討其與肺癌患者組織類型、性別、年齡、吸煙情況、分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況的關(guān)系，從而進(jìn)一步探討NGAL在肺癌中的作用。發(fā)現(xiàn)NGAL在肺腺癌組織比肺鱗癌組織中有較高陽性表達(dá)率，且二者的陽性表達(dá)率均遠(yuǎn)高于癌旁正常肺組織，說明NGAL有可能成為肺鱗癌及腺癌診斷和判斷預(yù)后的標(biāo)志物。有研究表明NGAL蛋白是一種新的鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)載體，與其受體一起介導(dǎo)了一條功能不同于轉(zhuǎn)鐵蛋白的新的鐵離子的傳導(dǎo)通路[6]。未與鐵離子結(jié)合的NGAL蛋白能夠清除表達(dá)NGAL受體細(xì)胞中的鐵離子，使細(xì)胞內(nèi)的鐵離子水平降低，而引起細(xì)胞凋亡。結(jié)合鐵離子的NGAL蛋白不能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[7]。當(dāng)然這僅僅是推斷，在肺癌中還沒有相關(guān)的驗證，我們可以以此為理論依據(jù)進(jìn)行研究肺癌的發(fā)生機(jī)制。

表1 NGAL的表達(dá)水平與肺鱗狀細(xì)胞癌臨床病理特征的關(guān)系

[1]Dizin E,Hasler U,Nlandu-Khodo S.Albuminuria induces a proinflammatory and profibrotic response in cortical collecting ducts via the 24p3 receptor[J].Am J Physiol Renal Physiol，2013,305(7):1053-1063.

[2]蔣奶貴,許麗艷,郭明洲.腫瘤相關(guān)蛋白 NGAL的生物學(xué)特征[J]．胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志,2010,19(4)：297-301.

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[6]Miethke M,Skerra A.Neutrophil gelatinase-associated lipocalin expresses antimicrobial activity by interfering with L-norepinephrine-mediated bacterial iron acquisition[J].Antimicrob A-gents Chemother,2010,54(4):1580-1589.

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