黑青稞籽皮提取物提高小鼠耐缺氧及抗疲勞能力的初步研究

賀敏++王慶軍（等）

[摘要] 目的 研究黑青稞籽皮提取物對(duì)小鼠耐缺氧及抗疲勞能力的影響。 方法 采用小鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，分別研究黑青稞籽皮提取物對(duì)常壓耐缺氧、亞硝酸鈉中毒、急性腦缺血小鼠存活時(shí)間的影響以及通過(guò)對(duì)異丙腎上腺素增加心肌耗氧、失血性休克小鼠心搏時(shí)間的影響的觀察評(píng)價(jià)其耐缺氧。利用負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)其抗疲勞功能。 結(jié)果 與生理鹽水組比較，黑青稞籽皮提取物在3.5 g/kg劑量條件下顯著延長(zhǎng)常壓耐缺氧小鼠的存活時(shí)間（P < 0.01），在4.0 g/kg劑量條件下能夠有效延長(zhǎng)斷頭小鼠喘氣時(shí)間（P < 0.05），在2.0 g/kg劑量條件下能夠延長(zhǎng)小鼠負(fù)重游泳時(shí)間（P < 0.05）。 結(jié)論 黑青稞籽皮提取物具有提高小鼠耐缺氧及抗疲勞能力的作用。

[關(guān)鍵詞] 黑青稞；籽皮提取物；耐缺氧；抗疲勞；小鼠

[中圖分類號(hào)] R284 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2014）10（a）-0007-04

Preliminary study of black barley pericarp extract on the ability of anti-hypoxia and anti-fatigue of mice

HE Min1 WANG Qingjun2 DING Xuejie1 LI Weijing1 REN Suping1 APei·Renpeng3 GUO Yan3 XUE Ping4 WANG Xuanlin1 YU Qun1

1.Beijing Institute of Transfusion Medicine， Beijing 100850， China； 2.Shenzhou Biological & Technology Co.， Ltd.， Inner Monggol Autonomous Region， Huhhot 010206， China； 3.Tibet Fanye Feihong Technology Co.， Ltd.， Tibet Autonomous Region， Lhasa 850001， China； 4.The 305th Hospital of People's Liberation Army， Beijing 100017， China

[Abstract] Objective To study the effects of black barley pericarp extract on the ability of anti-hypoxia and anti-fatigue of mice. Methods The effects of black barley pericarp extract on survival time of mice with anoxia endurance under normal pressure， sodium nitrite poisoning， acute cerebral ischemia. Injecting isoprenaline and hemorrhagic shock were used to assess the function of anoxia endurance， tests of burdened swimming were used to assess the function ofanti-fatigue. Results Compared with normal saline group， the black barley pericarp extract significantly prolonged the survival time of mice under hypoxia condition with 3.5 g/kg dose （P < 0.01）， and effectively prolonged gasp time of beheaded mice with 4.0 g/kg dose （P < 0.05）， and prolonged the swimming time of mice by the extract of black barley pericarp with 2.0 g/kg dose （P < 0.05）. Conclusion Black barley pericarp extract can enhance the function of anti-fatigue and anoxiaendurancein mice.

[Key words] Black barley； Pericarp extract； Anoxia endurance； Anti-fatigue； Mice

青稞（Hordeumvulgare ssp.vulgare）是一種生長(zhǎng)在高原低溫低氧環(huán)境中的農(nóng)作物，又稱裸大麥，是禾本科大麥屬作物，在世界許多國(guó)家和地區(qū)作為主要糧食作物已有幾千年歷史。在西藏，青稞品種資源很豐富，不同顏色、不同形狀的品種多達(dá)十幾個(gè)，有時(shí)在同一地區(qū)能發(fā)現(xiàn)7～8個(gè)青稞品種。青稞分為白青稞、黑青稞、墨綠色青稞等種類，其中，黑青稞是西藏特有品種，喜馬拉雅山北麓的山南地區(qū)措美縣因氣候、土壤特殊而盛產(chǎn)黑青稞，將其加工成糌粑后口感好，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，而且長(zhǎng)期服用對(duì)治療糖尿病、胃病等有明顯的療效，這是白青稞不具備的。黑青稞表皮中含有豐富花色苷，黃酮及類黃酮等物質(zhì)，藥理學(xué)研究表明，花色苷具有抗氧化、抗炎、降血脂、抑制腫瘤生成等生物學(xué)活性[1]。目前自然界已知的花色苷有20種以上，常見(jiàn)的主要有6種：矢車菊色素、天竺葵色素、飛燕草色素、芍藥色素、牽?；ㄉ睾湾\葵色素[2]，有5種糖分子參與構(gòu)成花色苷的糖基部分，分別為葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖[3]。Bakowska等[4]研究證明：花色苷是迄今為止所發(fā)現(xiàn)的最有效的天然水溶性自由基清除劑，其淬滅自由基的能力是維生素C的20倍，維生素E的50倍?；ㄉ湛稍鰪?qiáng)人的視力[5]、預(yù)防心腦血管疾病[6]和防治腫瘤等作用[7]，近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，矢車菊-3-氧-β-D-葡萄糖苷具有對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用[8]。筆者依據(jù)黑青稞生長(zhǎng)環(huán)境及其籽皮所含天然物質(zhì)，推測(cè)黑青稞籽皮提取物具有提高缺氧耐受力和抗疲勞能力的功效，本研究采用小鼠動(dòng)物藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，旨在為提供安全、綠色、低成本的食物原料來(lái)源作為耐缺氧保健品的開(kāi)發(fā)資源提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品

黑青稞原料由西藏蕃業(yè)飛虹科技有限公司提供；黑青稞籽皮提取物（由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院野戰(zhàn)輸血研究所提供）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供的SPF級(jí)健康昆明種小鼠200只，雄性，體重18～22 g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2012-0001。

1.3 主要儀器與試劑

儀器：動(dòng)物天平、分析天平、游泳箱、振蕩器、秒表等。

試劑：鈉石灰、生理鹽水、凡士林、亞硝酸鈉、異丙腎上腺素等。

1.4 方法

1.4.1 黑青稞籽皮提取物浸提工藝 黑青稞籽皮→50%乙醇浸提（條件：0.2%檸檬酸調(diào)pH 2；53℃水浴3 h；溶劑：料10∶1）→醇提液→減壓回收→提取物→常溫干燥。

1.4.2 常壓耐缺氧實(shí)驗(yàn) 小鼠隨機(jī)分為三組，每組10只，第一組以3.5 g/（kg·d）劑量灌胃給予黑青稞籽皮提取物（高劑量組），第二組以1.75g/（kg·d）劑量灌胃給予受試物（低劑量組），第三組灌胃給予同樣體積[0.2 mL·/（kg·d）]的蒸餾水（生理鹽水組），連續(xù)灌胃7 d。末次灌胃30 min后將小鼠放入200 mL磨口廣口瓶中，密封（瓶?jī)?nèi)放鈉石灰10 g以吸收O2，墊濾紙以吸收尿液，廣口瓶用前盛水校正容量，每瓶放1只小鼠），以呼吸停止為指標(biāo)，記錄小鼠存活時(shí)間。

1.4.3 亞硝酸鈉中毒實(shí)驗(yàn) 小鼠隨機(jī)分為三組，每組10只，第一組以4.0 g/kg劑量腹腔注射黑青稞籽皮提取物（高劑量組），第二組以2.0 g/kg的劑量腹腔注射受試物（低劑量組），第三組腹腔注射生理鹽水0.02 mL/g（生理鹽水組）。10 min后，兩組均注射2%亞硝酸鈉溶液，劑量為0.02 mL/g。記錄小鼠死亡時(shí)間。

1.4.4 急性腦缺血實(shí)驗(yàn) 小鼠隨機(jī)分為兩組，每組10只，第一組以4.0 g/kg劑量腹腔注射黑青稞籽皮提取物水溶液（高劑量組），第二組以2.0 g/kg劑量腹腔注射受試物（低劑量組），第三組腹腔注射生理鹽水0.02 mL/g（生理鹽水組）。10 min后，不需麻醉，用大剪刀在耳下部快速斷頭，記錄喘氣時(shí)間。

1.4.5 異丙腎上腺素增加心肌耗氧實(shí)驗(yàn) 小鼠隨機(jī)分為四組，每組10只，第一組按照0.015 mg/g劑量給小鼠皮下注射鹽酸異丙腎上腺素5 min后，以4.0 g/kg劑量腹腔注射黑青稞籽皮提取物（高劑量組）。第二組按照0.015 mg/g的劑量給小鼠皮下注射鹽酸異丙腎上腺素5 min后，以2.0 g/kg劑量腹腔注射黑青稞籽皮提取物（低劑量組）。第三組按照0.03 mL/g劑量給小鼠皮下注射生理鹽水5 min后，按照0.02 mL/g劑量給小鼠腹腔注射生理鹽水（生理鹽水組），第四組按0.015 mg/g劑量給小鼠皮下注射鹽酸異丙腎上腺素5 min后，按照0.02 mL/g劑量給小鼠腹腔注射生理鹽水（模型組）。上述四組小鼠處理10 min后，分別放入200 mL磨口廣口瓶?jī)?nèi)，密封。記錄小鼠存活時(shí)間。

1.4.6 對(duì)失血性休克小鼠心搏時(shí)間的影響實(shí)驗(yàn) 小鼠隨機(jī)分為三組，每組10只，第一組按照4.0 g/kg腹腔注射黑青稞籽皮提取物（高劑量組），第二組按照2.0 g/kg腹腔注射黑青稞籽皮提取物（低劑量組），第三組腹腔注射0.02 mL/g生理鹽水（生理鹽水組）。10 min后，不需麻醉，迅速斷頭，并剪開(kāi)胸皮及胸骨，打開(kāi)胸腔，暴露心臟，以心室停跳為指標(biāo)，記錄小鼠的心搏時(shí)間。

1.4.7 小鼠負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn) 小鼠隨機(jī)分為三組，每組10只，第一組以3.5 g/（kg·d）劑量灌胃給予黑青稞籽皮提取物（高劑量組），第二組以1.75 g/（kg·d）劑量灌胃給予受試物（低劑量組），第三組為對(duì)照組，灌胃給予同樣體積[0.2 mL/（kg·d）]的蒸餾水（生理鹽水組），連續(xù)灌胃7 d。末次給藥1 h后，在每只小鼠尾部加體重10%的負(fù)荷，放置于水溫（26±1）℃，水深20 cm的游泳槽內(nèi)，觀察小鼠的游泳時(shí)間，以小鼠沉到水底6 d內(nèi)不再游出水面為止。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 16.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1常壓耐缺氧實(shí)驗(yàn)

黑青稞籽皮提取物3.5 g/kg劑量組小鼠存活時(shí)間較生理鹽水組顯著延長(zhǎng)，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。見(jiàn)表1。

表1 黑青稞籽皮提取物對(duì)小鼠缺氧的影響（x±s）

注：與生理鹽水組比較，**P < 0.01

2.2亞硝酸鈉中毒實(shí)驗(yàn)

黑青稞籽皮提取物在所用劑量下未顯現(xiàn)出延長(zhǎng)亞硝酸鈉中毒小鼠存活時(shí)間的作用。見(jiàn)表2。

表2 黑青稞籽皮提取物對(duì)小鼠亞硝酸鈉中毒的影響（x±s）

2.3對(duì)小鼠急性腦缺血的影響

結(jié)果顯示，黑青稞籽皮提取物在高、低劑量下均能顯著延長(zhǎng)急性斷頭小鼠喘氣時(shí)間，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.05）。見(jiàn)表3。

表3 黑青稞籽皮提取物對(duì)小鼠急性腦缺血的影響（x±s）

注：與生理鹽水組比較，*P < 0.05

2.4 異丙腎上腺素對(duì)心肌耗氧的影響

黑青稞籽皮提取物在高、低劑量下未顯現(xiàn)出心肌耗氧的改善作用。見(jiàn)表4。

表4 黑青稞籽皮提取物對(duì)異丙腎上腺素增加小鼠心肌耗氧的影響（x±s）

2.5 對(duì)失血性休克小鼠心搏時(shí)間的影響

黑青稞籽皮提取物在所用劑量下對(duì)失血性休克小鼠心搏時(shí)間未顯現(xiàn)出延長(zhǎng)作用。見(jiàn)表5。

表5 黑青稞籽皮提取物對(duì)失血性休克小鼠心搏時(shí)間的影響（x±s）

2.6小鼠負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)

黑青稞籽皮提取物在高劑量條件下有效延長(zhǎng)小鼠負(fù)重游泳時(shí)間，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），提示其具有抗疲勞能力。見(jiàn)表6。

表6 黑青稞籽皮提取物對(duì)小鼠負(fù)重游泳時(shí)間的影響（x±s）

注：與生理鹽水組比較，*P < 0.05

3 討論

通過(guò)黑青稞籽皮提取物對(duì)小鼠耐缺氧及抗疲勞能力影響的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，筆者得到了如下的結(jié)論并進(jìn)行了分析：①小鼠在密閉容器中受缺氧因素?fù)p害，主要反映在心和腦缺氧。由于常壓耐缺氧為非特異性缺氧，數(shù)據(jù)顯示黑青稞籽皮提取物顯著延長(zhǎng)了小鼠的存活時(shí)間，說(shuō)明對(duì)腦缺氧或心肌缺血有改善作用。②在斷頭實(shí)驗(yàn)中，腦血液供應(yīng)中斷，但腦中原有的血和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)尚能使腦功能維持一段時(shí)間，表現(xiàn)在小鼠規(guī)律地喘氣，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)反映出黑青稞籽皮提取物明顯延長(zhǎng)小鼠的喘氣時(shí)間，能夠使腦耗能減少，對(duì)斷頭腦缺氧有保護(hù)作用。③在亞硝酸鈉致小鼠全身組織中毒性缺氧實(shí)驗(yàn)、對(duì)抗異丙腎上腺素引起的心肌耗氧增加所致心肌缺血實(shí)驗(yàn)、失血性休克小鼠心搏時(shí)間的影響實(shí)驗(yàn)中，黑青稞籽皮提取物未顯示出緩解或改善作用。黑青稞籽皮提取物顯示有效延長(zhǎng)小鼠負(fù)重游泳時(shí)間的作用，顯示出提高抗疲勞能力的作用。

缺氧對(duì)機(jī)體是一種緊張性刺激，影響機(jī)體各種代謝，特別是影響機(jī)體的氧化供能，最終會(huì)導(dǎo)致機(jī)體的心、腦等重要器官缺氧或損傷，引起氧供應(yīng)能力不足而死亡[9-10]，高原低壓性缺氧干擾機(jī)體正常的氧化反應(yīng)，造成細(xì)胞代謝和功能的紊亂，從而對(duì)機(jī)體的組織、器官產(chǎn)生損害。腦是機(jī)體主要的耗氧器官，具有較高的脂質(zhì)容量和較低的抗氧化儲(chǔ)備能力，對(duì)高原急性低壓缺氧損害具有很高的敏感性[10]。目前，紅景天是應(yīng)用最為廣泛的天然藥物資源，紅景天生長(zhǎng)環(huán)境特殊，生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，脆弱的生態(tài)環(huán)境很容易破壞，有部分人工種植和移栽研究，但規(guī)?；N植未見(jiàn)報(bào)道[11]。為了解決資源的可持續(xù)利用，學(xué)者們都在不斷尋找防治高原缺氧的天然植物，以期替代紅景天這一珍貴藥用資源[12-15]。本實(shí)驗(yàn)用小鼠藥效學(xué)證明了黑青稞提取物對(duì)急性腦缺氧具有顯著的保護(hù)作用，提高小鼠耐缺氧能力，具備開(kāi)發(fā)為耐缺氧保健食品的潛力。

經(jīng)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院儀器測(cè)試分析中心高效液相色譜檢測(cè)，黑青稞籽皮提取中物總花色苷含量占籽皮提取物的7.6%，主要存在的天然花色苷物質(zhì)為氯化花翠素（含量為5.7%）。目前，花色苷對(duì)心肌細(xì)胞缺氧保護(hù)作用的研究熱點(diǎn)是矢車菊素-3-O-葡萄糖苷[16]，對(duì)氯化花翠素的耐缺氧作用研究較少。缺氧導(dǎo)致機(jī)體抗氧化能力下降，各種酶系統(tǒng)與非酶系統(tǒng)會(huì)產(chǎn)生大量活性氧（ROS），ROS攻擊生物膜中的酶和不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化作用，形成以丙二醛為主的多種過(guò)氧化物[17]。筆者的前期工作證明了黑青稞籽皮提取物通過(guò)保護(hù)線粒體跨膜電位，抑制了活性氧產(chǎn)生，從而減少了活性氧對(duì)心肌細(xì)胞的損傷作用。由于黑青稞籽皮提取物中主要活性物質(zhì)為類黃酮，因此筆者將進(jìn)一步分離、純化并進(jìn)行相關(guān)細(xì)胞學(xué)驗(yàn)證，以期明晰黑青稞籽皮提取物耐缺氧的功效成分是有效部位還是單一成分，為黑青稞的耐缺氧保健功能食品的開(kāi)發(fā)奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2014-06-16 本文編輯：衛(wèi) 軻）