一株紅螺菌科光合細(xì)菌培養(yǎng)基的配比優(yōu)化

李立欣，羅克潔，唐二葵，馬 放

( 1．黑龍江科技大學(xué)環(huán)境與化工學(xué)院，哈爾濱150022; 2．哈爾濱工業(yè)大學(xué)城市水資源與水環(huán)境國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150090)

一株紅螺菌科光合細(xì)菌培養(yǎng)基的配比優(yōu)化

李立欣1，羅克潔1，唐二葵1，馬 放2

( 1．黑龍江科技大學(xué)環(huán)境與化工學(xué)院，哈爾濱150022; 2．哈爾濱工業(yè)大學(xué)城市水資源與水環(huán)境國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150090)

為獲得一種高效培養(yǎng)光合細(xì)菌L－01的方法，采用表征菌體密度的參數(shù)OD660作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)分析其對(duì)碳源、氮源、磷源和生長(zhǎng)因子的利用能力。結(jié)果表明，乙酸鈉為光合細(xì)菌L－01的最大影響因子，其優(yōu)化培養(yǎng)基配方為:乙酸鈉7 g/L、氯化銨0. 25 g/ L、磷酸氫二鉀0. 1 g/L、酵母膏0. 2 g/L、氯化鎂0. 2 g/L和九水硫化鈉0. 3 g/L。該結(jié)果為高密度培養(yǎng)光合細(xì)菌提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

光合細(xì)菌;培養(yǎng)基;優(yōu)化;正交實(shí)驗(yàn)

收稿日期: 2013－12－16
基金項(xiàng)目:“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目( 2012BAD14B06－04) ;黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目( 12513088)
第一作者簡(jiǎn)介:李立欣( 1980－)，男，黑龍江省鶴崗人，講師，博士研究生，研究方向:環(huán)境微生物及藻類固定化技術(shù)與工藝，E-mail: lilixin1980@163．com。

0引言

光合細(xì)菌( photosynthetic bacteria，PSB)是一類以光作為能源，能在光照厭氧或黑暗好氧條件下利用有機(jī)物、硫化物、氨等作為供氫體兼碳源進(jìn)行光合作用的微生物［1］。它與其他高等植物和藻類相比，最大的區(qū)別就是僅限于厭氧光照條件下生長(zhǎng)且不產(chǎn)生氧氣［2］。在自然界中，光合細(xì)菌分布極其廣泛，只要有水和光存在，不論在好氧和厭氧環(huán)境如土壤、泥潭沼澤、海水、淡水、下水污泥、水生植物根系等均能生長(zhǎng)繁殖。目前所知的光合細(xì)菌可分為著色桿菌科、紫色非硫細(xì)菌、外硫紅螺菌科、螺旋桿菌科、綠色硫細(xì)菌、含細(xì)菌葉綠素的專性好氧菌、多細(xì)胞絲狀綠細(xì)菌等七大類群［3］。

光合細(xì)菌菌體含有多種物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、多種B族維生素、泛酸、輔酶Q等生理活性物質(zhì)，同時(shí)含有菌綠素、類胡蘿卜素等天然色素，其用途極為廣泛，具有很強(qiáng)的回收價(jià)值［4］。隨著人們對(duì)光合細(xì)菌研究的不斷深入，證明光合細(xì)菌在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、水產(chǎn)養(yǎng)殖、畜牧業(yè)、生物制氫、生物制藥、重金屬?gòu)U水處理和有機(jī)污水處理方面均有很好的應(yīng)用價(jià)值［5－9］。

基于光合細(xì)菌在水處理等方面的優(yōu)勢(shì)，本應(yīng)加大推廣力度，但由于用于培養(yǎng)光合細(xì)菌的培養(yǎng)基具有平均富集時(shí)間較長(zhǎng)、培養(yǎng)基成分種類多以及成本較高等不足，所以限制了光合細(xì)菌在生產(chǎn)上的廣泛應(yīng)用［5］。為此，筆者以光合細(xì)菌中的紅假單胞菌屬為材料，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交實(shí)驗(yàn)方法對(duì)光合細(xì)菌的培養(yǎng)基條件進(jìn)行優(yōu)化，得到改進(jìn)的培養(yǎng)基配方，為下一步光合細(xì)菌的開(kāi)發(fā)及利用提供參考依據(jù)。

1實(shí)驗(yàn)材料與方法

1．1實(shí)驗(yàn)材料

菌種為課題組從黑龍江科技大學(xué)水處理站活性污泥中分離獲得并培養(yǎng)保存，經(jīng)初步鑒定為紅假單胞菌屬( Rhodopseudomonas sp．)，命名為L(zhǎng)－01。

培養(yǎng)基成分與質(zhì)量濃度:磷酸氫二鉀0. 5 g/L、乙酸鈉4 g/L、氯化銨0. 5 g/L、酵母膏0. 5 g/L、氯化鎂0. 2 g/L、九水硫化鈉0. 3 g/L、pH值7. 0。

培養(yǎng)條件以質(zhì)量濃度20%的接種量將光合細(xì)菌L－01菌種接種于滅菌的試劑瓶中，在光照培養(yǎng)箱中3 000 lux光照強(qiáng)度下厭氧培養(yǎng)，pH =7. 0，溫度30℃，培養(yǎng)時(shí)間為7 d。每一實(shí)驗(yàn)組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

菌種光密度值測(cè)定采用723型分光光度計(jì)。在660 nm處測(cè)定OD值，以此來(lái)判斷菌種的生長(zhǎng)狀況。

1. 2培養(yǎng)基單因子優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

根據(jù)培養(yǎng)基的主要組成成分，以及前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)置了4組單因素實(shí)驗(yàn)，分別為碳源(乙酸鈉1.0～9.0 g/L)、氮源(氯化銨0.25～1.25 g/L)、磷源(磷酸氫二鉀0.10～0.50 g/L)、生長(zhǎng)因子(酵母膏0.2～1.0 g/L)。

1. 3 正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果設(shè)計(jì)了4因素3水平的正交實(shí)驗(yàn)，采用L9( 34)正交表篩選光合細(xì)菌L－01的最佳培養(yǎng)基配方，正交實(shí)驗(yàn)的因素水平見(jiàn)表1。

表1 L9( 34)正交實(shí)驗(yàn)因素水平Table 1 Factors and levels of L9( 34) orthogonal experiment g/L

2結(jié)果與分析

2．1培養(yǎng)基單因子對(duì)光合細(xì)菌生長(zhǎng)的影響

分別添加不同質(zhì)量濃度的碳源(乙酸鈉)、氮源(氯化銨)、磷源(磷酸氫二鉀)和營(yíng)養(yǎng)因子(酵母膏)，考察對(duì)光合細(xì)菌L－01生長(zhǎng)的影響。從圖1a可以看出，乙酸鈉的質(zhì)量濃度對(duì)光合細(xì)菌L－01生長(zhǎng)影響較大，隨著添加量的增加有利于光合細(xì)菌L－01的生長(zhǎng)，在添加量5～9 g/L時(shí)，光合細(xì)菌L－01的OD值差異并不顯著?？紤]到添加量大必然會(huì)增加大規(guī)模培養(yǎng)的成本，因此乙酸鈉添加量為5 g/ L左右較為適宜。在氯化銨添加實(shí)驗(yàn)組中，從圖1b可以看出，適量的氯化銨能夠促進(jìn)光合細(xì)菌L－01的生長(zhǎng)，而過(guò)量的氯化銨反而會(huì)抑制其生長(zhǎng)，選擇0. 75 mg/L的氯化銨較為理想。圖1c為不同磷酸氫二鉀質(zhì)量濃度下光合細(xì)菌L－01的光吸收值，當(dāng)磷酸氫二鉀添加量過(guò)低時(shí)，菌液OD值也能達(dá)到1. 0以上，說(shuō)明光合細(xì)菌L－01對(duì)磷源的需求量并不大。隨著磷酸氫二鉀添加量的增加對(duì)光合細(xì)菌的生長(zhǎng)量影響不大，當(dāng)添加量大于0. 3 mg/L時(shí)，OD值略有下降，說(shuō)明較低添加量有利于光合細(xì)菌L－01的生長(zhǎng)。酵母膏添加對(duì)光合細(xì)菌L－01生長(zhǎng)影響見(jiàn)圖1d。實(shí)驗(yàn)中適量添加酵母膏有利于光合細(xì)菌L－01的生長(zhǎng)，當(dāng)添加質(zhì)量濃度較低時(shí)，隨著添加量的增加OD值增加，當(dāng)添加量達(dá)到0. 6 g/L時(shí)，OD值達(dá)到最大。大于0. 6 g/L的添加量時(shí)，抑制了光合細(xì)菌L－01的生長(zhǎng)。雖然光合細(xì)菌L－01培養(yǎng)初期生長(zhǎng)迅速，菌密度增長(zhǎng)迅速，但菌體易出現(xiàn)老化，易出現(xiàn)細(xì)胞碎片附壁、死細(xì)胞附壁和聚團(tuán)成塊現(xiàn)象。為減少其他雜菌污染，結(jié)合生產(chǎn)中要降低成本，酵母膏最適添加量為0. 2～0. 6 g/L。

圖1四種單因子添加量對(duì)L－01生長(zhǎng)的影響Fig．1 Effects of adding concentration of nutrition factors respectively on growth of PSB L－01

2. 2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。從表2中的極差R值可以看出，各因素影響光合細(xì)菌生長(zhǎng)的主次順序?yàn)? B＞D＞A＞C，即乙酸鈉質(zhì)量濃度對(duì)光合細(xì)菌L－01生長(zhǎng)的影響最為顯著，酵母膏質(zhì)量濃度對(duì)光合細(xì)菌L－01生長(zhǎng)的影響次之，氯化銨質(zhì)量濃度對(duì)光合細(xì)菌L－01生長(zhǎng)的影響最小。該結(jié)果與鐘為章等［2］研究結(jié)果一致，說(shuō)明兩株菌利用碳源及氮源等營(yíng)養(yǎng)元素能力較為相似，可以推斷乙酸鈉作為碳源是光合細(xì)菌生長(zhǎng)較為理想的營(yíng)養(yǎng)成分，有研究顯示加大碳源的用量，可以增長(zhǎng)光合細(xì)菌生長(zhǎng)［10］。酵母膏質(zhì)量濃度對(duì)光合細(xì)菌L－01影響較大，這主要是由于酵母膏營(yíng)養(yǎng)豐富，為光合細(xì)菌提供各種生長(zhǎng)因子，促進(jìn)光合細(xì)菌的生長(zhǎng)［11］。氯化銨和磷酸氫二鉀質(zhì)量濃度對(duì)光合細(xì)菌L－01影響較小，說(shuō)明光合細(xì)菌L－01對(duì)氮源及磷源的質(zhì)量濃度要求很低，低質(zhì)量濃度氮源和磷源條件下光合細(xì)菌L－01生長(zhǎng)代謝仍然旺盛。

表2正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal experiment

根據(jù)表2均值大小，最佳培養(yǎng)基配方組為A3B3C1D1，但綜合極差R大小、營(yíng)養(yǎng)因子均值差以及成本考慮，筆者認(rèn)為A1B3C1D1為光合細(xì)菌L－01的最佳培養(yǎng)基配方，即磷酸氫二鉀0. 1 g/L、乙酸鈉7 g/L、氯化銨0. 25 g/L、酵母膏0. 2 g/L。

3結(jié)論

培養(yǎng)基中四種主要單因素營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)光合細(xì)菌L－01的生長(zhǎng)影響依次為乙酸鈉、酵母膏、磷酸氫二鉀、氯化銨。根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)確定最佳培養(yǎng)基配方，即乙酸鈉7 g/L、磷酸氫二鉀0. 1 g/L、氯化銨0. 25 g/ L、酵母膏0. 2 g/L、氯化鎂0. 2 g/L和九水硫化鈉0. 3 g/L。

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(編輯 徐 巖)

Optimization of medium for strains photosynthetic bacteria of Rhodospirillaceae

LI Lixin1，LUO Kejie1，TANG Erkui1，MA Fang2
( 1．School of Environmental＆Chemical Engineering，Heilongjiang University of Science＆Technology，Harbin 150022，China; 2．State Key Laboratony of Urban Water Resource＆Environment，Harbin Institute of Technology，Harbin 150090，China)

This paper features a highly effective approach to culturing photosynthetic bacteria L－01．The approach is developed by analyzing photosynthetic bacteria L－01’s capability of using carbon source，nitrogen source，phosphorus source，and growth factor，using as the evaluation index the parameter OD660characterizing the density of bacteria and by virtue of single factor experiment and orthogonal experiment analysis．The analysis finds that acetate sodium behaves as the biggest impact factor of photosynthetic bacteria L－01，with the optimized culture medium ingredients composed of CH3COONa 7 g/L，NH4Cl 0．25 g/L，KH2PO40．1 g/L，yeast extract 0．2 g/L，MgCl20．2 g/L and NaS·9H2O．The finding may serve as the basic data for high-density culturing of photosynthetic bacteria．

photosynthetic bacteria; culture medium; optimization;orthogonal experiment

10. 3969/j．issn．2095－7262. 2014. 02. 007

Q935

2095－7262( 2014) 02－0141－03

A