青枯無致病力菌株對煙草青枯病控病研究及機理初探

周幫菊 肖崇剛 肖田 李飛雄

摘 要 本實驗以無致病力青枯菌為材料，針對煙草青枯病進行了控病及機理的初步研究。結(jié)果顯示，溫室控病中各菌株傷根接種相對防效高于灌根接種，Aujd5-2y溫室控病相對防效為80.49%，其田間相對防效高于農(nóng)用鏈霉素，其抗藥性突變株在煙草根表和體內(nèi)可短暫定殖。Au004-1、Tmjd1-3可誘導煙草產(chǎn)生抗病性生理生化變化，表現(xiàn)為PAL、POD、PPO活性增加，病程相關(guān)蛋白量的積累。

關(guān)鍵詞 無致病力菌株；煙草青枯病；生物防治

中圖分類號：S476+.1 文獻標志碼：A 文章編號：1673-890X（2014）27--04

煙草青枯病是由青枯雷爾氏菌引起的一種系統(tǒng)性土傳病害，在煙草苗期和大田期均可能發(fā)生。該病廣泛分布于全世界的熱帶、亞熱帶和一些溫暖的地區(qū)，一旦發(fā)生即造成全株死亡，對煙草的產(chǎn)量和質(zhì)量影響極大。利用青枯無致病力·菌株對青枯病菌進行防治的報道已有很多，但用到生產(chǎn)上的很少。對其控病機制目前主要有兩種觀點：一是認為細菌素是主要的控病因子；二是認為誘導了寄主的抗病性。朱育菁等通過研究強致病力與無致病力菌株生長競爭關(guān)系，認為無致病產(chǎn)細菌素的青枯勞爾氏菌對青枯病具有較好的短期防效，除了細菌素和誘導抗性外，可能還與菌株之間的生態(tài)競爭有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株：無致病力青枯菌Tbw1-7-1-1、Tb1-7-1-3、Tm002-2r、Tbw1-7-3、Aujd5-2y、 Au004-1、Tmjd1-3，致病菌FL-9-1；煙草品種：MSK326；對照藥劑：農(nóng)用鏈霉素（石家莊曙光制藥廠）；抗生素：注射用硫酸鏈霉素（華北制藥股份有限公司）、利福平（成都錦華藥業(yè)股份有限責任公司）。

1.2 方法

1.2.1 煙草青枯病溫室控病試驗

待測菌為Tbw1-7-1-1、Tb1-7-1-3、Tm002-2r、Tbw1-7-3、Aujd5-2y，采用傷根和灌根接種。灌接接種：選取5～7葉煙苗，4.0×108 cfu/mL ，10 mL/株，灌接待測菌發(fā)酵液，每菌10株，3次重復。7 d后傷根灌接FL-9-1，3.0×108 cfu/mL，10 mL/株，放于30℃溫室中待其發(fā)病。傷根接種參考鄭繼法的方法，菌液濃度和量同灌根接種。設(shè)置藥劑對照（CK藥，農(nóng)用鏈霉素100 μg/mL，10 mL/株灌根）、空白對照（CK空白）和發(fā)病對照（CK病）。分級標準參照肖永生等。

1.2.2 煙草青枯病田間小區(qū)控病試驗

煙苗移栽前7 d將FL-9-1發(fā)酵液200 mL/m2均勻噴霧到土中制備病圃，濃度為3.0×108 cfu/mL。移栽前7 d將待測菌發(fā)酵液10 mL/株灌在煙苗根部，移栽后7 d及見到CK病發(fā)病時，待測菌發(fā)酵液100 mL/株各灌根一次，濃度均為8×108 cfu/mL。CK藥：移栽后7 d、見到CK病發(fā)病時各用 150 μg/mL農(nóng)用鏈霉素100 mL/株灌根。

1.2.3 抗藥性標記及在煙草體內(nèi)的定殖

對Aujd5-2y進行抗藥性標記，對得到的突變株檢測平板抑菌活性。突變株接種方法、濃度、量、時間及煙苗的管理方式與溫室控病試驗一致。組織印跡法、稀釋平板法檢測：兩種方法處理后第0.5、3、7、14、21、30 d分別進行檢測。

1.2.4 青枯菌無致病力菌株誘導煙草抗病性

接種處理：傷根接種（同溫室控病），CK灌等量無菌水。分別在處理后1、3、5、7、9、11 d后采集葉片（從上向下第四張完全展開葉片），每個樣重復3次，取平均值。

苯丙氨酸解氨酶（PAL）提取及活性測定、過氧化物酶（POD）的提取及活性測定，多酚氧化酶（PPO）的提取及活性測定。病程相關(guān)蛋白（PRP）的提取及電泳：將待測菌株菌懸液傷根灌接，以灌施等量無菌水為對照。3 d后采集處理植株的第4～6片葉0.5 g，除去主脈，參照江山等、Boller T H的細胞間隙可溶性蛋白的提取法，提取溶液經(jīng)電泳分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫室控病試驗

本試驗將5個無致病力菌株用于溫室盆栽控病試驗。接種青枯致病菌28 d后，CK空白未見有發(fā)病，菌株Tbw1-7-3、Aujd5-2y傷根處理在接種青枯菌7 d后未出現(xiàn)青枯癥狀，其它菌株處理已在發(fā)病，可見這兩個菌株可推遲煙草青枯病發(fā)病，28 d后這兩個菌株傷根接種的相對防效為80.49%，較CK藥及其它菌株處理高，且差異顯著，各菌株傷根接種相對防效大于灌根的相對防效（見表1）。

表1 溫室控病試驗結(jié)果

處理 接種方法 發(fā)病率（%） 病情指數(shù) 相對防效（%）

CK病

CK藥

Tbw1-7-3

Aujd5-2y

Tm002-2r

Tbw1-7-1-3

Tbw1-7-1-1

不傷根

傷根

不傷根

傷根

不傷根

傷根

不傷根

傷根

不傷根

傷根 80.00

26.67

26.67

20.00

26.67

23.33

40.00

33.33

46.67

43.33

43.33

40.00 68.33

20.00

15.00

13.33

15.83

13.33

32.50

26.67

35.00

33.33

34.17

32.50

73.17a

78.05b

80.49c

76.83d

80.49c

52.44e

60.67f

48.78g

51.22h

49.99i

52.44j

注：不同字母表示在p=0.05水平上差異顯著。

2.2 田間小區(qū)控病試驗

煙苗移栽到田間30 d后，田間發(fā)病對照處理開始出現(xiàn)發(fā)病植株，以后每5 d調(diào)查一次田間發(fā)病情況。拮抗菌處理和藥劑處理在對照發(fā)病后5 d未見發(fā)病煙株，煙苗移栽60 d后兩菌株處理后對煙草青枯病的相對雖不理想，但菌株Aujd5-2y 處理后對煙草青枯病的相對防效比供試藥劑農(nóng)用鏈霉素處理后的相對防效高（圖1）。

注：圖中時間為發(fā)病對照發(fā)病后天數(shù)

圖1 田間小區(qū)控病試驗相對防效

2.3 抗藥性標記及在煙草體內(nèi)的定殖

抗藥性標記得到同時抗Stre 250 μg/mL和Rif 200 μg/mL的突變株Aujd5-2yk。該菌株在NA平板上對青枯菌有抑菌活性。兩種方法接種該突變株后0.5～28 d組織印跡法都可在根表檢測到，而葉、莖表面均未檢測到。稀釋平板法一定時間后在煙草根、莖、葉內(nèi)均可檢測到，說明該菌可以在煙草體內(nèi)定殖，且可以轉(zhuǎn)移。傷根接種處理的煙草體內(nèi)檢測到該菌的時間較灌根接種時間早，且檢測到的菌量大于同期灌根接種處理。兩種方法處理后煙草體內(nèi)菌量都呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，說明該菌株在煙草體內(nèi)只能短暫定殖（圖2，圖3，圖4）。

圖2 Aujd5-2yk在煙草根內(nèi)的消長動態(tài)

圖3 Aujd5-2yk在煙草莖內(nèi)的消長動態(tài)

圖4 Aujd5-2yk在煙草葉內(nèi)的消長動態(tài)

2.4 青枯無致病力菌株誘導煙草抗病性

Au004-1處理后，煙葉中PAL活性逐漸上升后下降，上升后再次下降，在第5、9 d分別達到峰值，與CK的變化一致，在11 d內(nèi)大部分時間高于CK（見圖5）；POD活性前3 d低于CK，之后迅速增強，5 d后達到最大值后又下降，9 d后達到另一個峰值，隨后又下降，并在3～7 d、7～11 d兩個時間段大大強于CK（圖6），CK則變化較??；PPO活性前3 d低于CK，隨后逐漸增強，11 d時達到最大值，其后可能仍有上升的趨勢（圖7）。Tmjd1-3處理后，煙葉中PAL活性與CK的變化趨勢基本一致，且始終高于CK（圖5）；POD活性則相對較穩(wěn)定，且在大部分時間高于CK（見圖6）；而PPO變化與CK基本一致，7 d前緩慢上升，其后開始迅速下降，9 d后又迅速上升達到高峰，并一直高于CK，（見圖7）。

這些變化表明Au004-1和Tmjd1-3分別誘導煙草產(chǎn)生對青枯病的抗性均與PAL、POD、PPO活性相關(guān)。

圖5 兩菌株處理煙草葉片中PAL活性變化

圖6 兩菌株處理煙草葉片中POD活性變化

圖7 兩菌株處理煙草葉片中POD活性變化

與CK比較，兩菌株分別處理煙草后，電泳圖譜雖沒有出現(xiàn)新的蛋白帶，但著色較深，尤其Au004-1處理的每個帶都比CK的著色深，表明Au004-1和Tmjd1-3分別處理煙草后產(chǎn)生的抗病性與體內(nèi)產(chǎn)生的PRP有關(guān)，主要表現(xiàn)為蛋白量的積累（見圖8）。

3 討論

5個菌株溫室控病試驗結(jié)果顯示，傷根接種對煙草青枯病的相對防效大于灌根接種。Aujd5-2y在田間對青枯病有一定的拮抗作用。Aujd5-2yk定殖試驗和誘導煙草產(chǎn)生生理生化試驗結(jié)果顯示，無致病力菌株的控病機理應該是定殖位點的占據(jù)和誘導煙草產(chǎn)生抗病性，是否與細菌素的產(chǎn)生有關(guān)還有待進一步的研究。

任欣正等認為傷口有利于拮抗菌侵入番茄體內(nèi)，本研究得出了相同的結(jié)果。在傷根接種Aujd5-2yk 0.5 d后可在煙草根內(nèi)分離到，而灌根接種3 d后方能分離到，說明傷根造成的傷口有利于其進入煙草體內(nèi)。青枯菌進入植物體內(nèi)的主要通道是傷口，傷根接種在煙草根部造成了傷口，更有利于其進入寄主體內(nèi)。本試驗中傷根處理后在煙草體內(nèi)分離到的菌量均大于灌根處理，這說明傷根后標記菌株先進入煙草內(nèi)，優(yōu)先占據(jù)了煙草體內(nèi)的定殖位點并在煙草體內(nèi)增殖，因此，分離到的標記菌株數(shù)量就多，這也在一定程度上解釋了為什么傷根接種拮抗菌相對防效大于灌根接種。

本試驗發(fā)現(xiàn)Aujd5-2yk可在煙草根表和土壤中存活，且在煙草體內(nèi)轉(zhuǎn)移并定殖，但不能從體內(nèi)轉(zhuǎn)移到莖葉表面，其在煙草體內(nèi)的數(shù)量呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，說明該菌在煙草體內(nèi)只能短暫定殖，原因可能是其它微生物的存在抑制了該菌的增殖，還可能與營養(yǎng)、土壤濕度、環(huán)境溫度等相關(guān)，具體原因還有待進一步的研究。試驗結(jié)果顯示，接種Aujd5-2yk 14天后煙草體內(nèi)的菌量開始下降，在田間應用中，可在上次施用后10～15 d再次施用，增加寄主體內(nèi)拮抗菌數(shù)量以達到控病的目的。

菌株Au004-1和Tmjd1-3對青枯菌具有體外抑制作用和誘導煙草產(chǎn)生對青枯病的抗病作用，這與前人的研究相似；兩菌株分別誘導煙草產(chǎn)生新的PRP，只是表現(xiàn)為含量的增加。這可能是由于試驗菌株不是來自煙草本身，而是分別從茄和番茄青枯病株上分離得到，雖然激活了煙草本身的抗病代謝過程，但在這一過程中并沒有新PRP產(chǎn)生，這種情況也可能由于新PRP產(chǎn)生量很少或已轉(zhuǎn)化以致檢測不到。

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（責任編輯：劉昀）