固定化菌株DF51對小麥幼苗的苯酚污染修復(fù)

張謹(jǐn)華，王慧陽，邵青玲，武玉珍

（晉中學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，山西晉中 030600）

小麥?zhǔn)呛瘫究菩←湆僦参锏慕y(tǒng)稱，在世界各地廣泛種植.小麥中碳水化合物約占75%，蛋白質(zhì)約占10%，它富含淀粉、蛋白質(zhì)、脂肪、礦物質(zhì)、鈣、鐵、硫胺素、核黃素、煙酸、維生素A及維生素C等.2010年，小麥?zhǔn)鞘澜缟峡偖a(chǎn)量位居第二的糧食作物（6.51億噸），僅次于玉米（8.44億噸）.苯酚是農(nóng)藥、化學(xué)品的重要的工業(yè)生產(chǎn)原料[1]，是工業(yè)廢水的主要污染物之一.國內(nèi)對苯酚毒性的研究較多，主要有魚類的急性毒性實(shí)驗(yàn)[2，3]、以苯酚為原材料合成的雙酚A等毒理性研究[4，5]，而對于植物方面的研究則相對較少，彭永康等[6]報(bào)道過，40mg/L的苯酚溶液對黃瓜、番茄等蔬菜種子的萌發(fā)以及主胚根的生長有抑制作用，祁忠占等[7]對小麥?zhǔn)艿奖椒佣竞蠖喾友趸竿っ富钚赃M(jìn)行了研究，覃廣泉等[8]對菜心受苯酚脅迫進(jìn)行了報(bào)道.目前對苯酚對小麥幼苗株高及SOD等酶活性的影響的評價(jià)較少.本實(shí)驗(yàn)通過苯酚與固定化菌株DF51處理土壤，研究了苯酚與固定化菌株DF51配合施用對小麥幼苗凈光合速率（Pn）、胞間CO2濃度（Ci）、葉綠素相對含量（CCI）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）等的影響.為評價(jià)固定化菌株DF51對苯酚污染土壤的修復(fù)及其對小麥幼苗的影響，進(jìn)一步探討固定化菌株DF51增強(qiáng)苯酚脅迫下小麥耐性的作用機(jī)理提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 供試材料

普通小麥（晉麥47）種子由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)作物化學(xué)調(diào)控中心提供；苯酚為分析純試劑，固定化的苯酚降解菌株DF51均由晉中學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供.

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2012年5月至2013年10月在晉中開發(fā)區(qū)農(nóng)業(yè)試驗(yàn)田小麥小區(qū)進(jìn)行，試驗(yàn)地為黃土狀母質(zhì)上發(fā)育的碳酸鹽褐土，水澆地.耕層（0～20 cm）土壤含有機(jī)質(zhì)1.74 g/kg，全氮0.0636 g/kg，速效磷6.69mg/kg，速效鉀185.2mg/kg，pH值7.68.采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，小區(qū)面積為6m2（3m×2m），種植密度90000株/hm2，每小區(qū)54株，3次重復(fù)，田間管理同大田.

試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì)，苯酚與固定化菌株施用時(shí)與耕層土壤混勻.苯酚P設(shè)4個(gè)P處理質(zhì)量濃度（濃度以風(fēng)干土壤計(jì)）：P0（0μg/g）、P1（50μg/g）、P2（100μg/g）、P3（150μg/g）、P4（200μg/g）；固定化菌株DF51設(shè)5個(gè)D處理水平：D0（0 kga.i./hm2）、D1（10 kga.i./hm2）、D2（20 kga.i./hm2）、D3（30 kga.i./hm2）、D4（40 kga.i./hm2）.

1.3 測定指標(biāo)及方法

取冬小麥幼苗為材料，用SPAD-250、光合儀CI-340分別測定葉片葉綠素含量與光合特性；同時(shí)取葉片測定SOD、POD活性[8]；取均值.用Statistical Analysis System（SAS）和Microsoft Excel（Office 2003）軟件進(jìn)行顯著性分析，Duncan新復(fù)極差法多重比較分析在0.05水平上進(jìn)行.

2 結(jié)果與分析

2.1 苯酚污染及修復(fù)對小麥幼苗葉綠素含量的影響

圖1可知，隨苯酚濃度的升高CCI呈顯著降低趨勢；單施固定化菌株DF51時(shí)，隨固定化菌株DF51濃度的增加對

CCI的影響均不顯著；同時(shí)施用苯酚和固定化菌株DF51時(shí)，隨固定化菌株DF51濃度的增加CCI呈不同程度的上升趨勢，處理之間差異顯著.經(jīng)方差分析和Duncan新復(fù)極

差法多重比較可知：苯酚和固定化菌株的交互作用對CCI的影響達(dá)到顯著水平.說明苯酚對小麥幼苗造成脅迫，使其葉片的葉綠素含量降低；固定化菌株DF51可增加苯酚脅迫下小麥幼苗的CCI；不同的苯酚水平以D4處理時(shí)CCI最大，苯酚處理濃度越低CCI越大.表明固定化菌株DF51可增強(qiáng)苯酚脅迫下小麥幼苗的葉綠素含量.

圖1 苯酚污染及修復(fù)對小麥幼苗葉綠素含量的影響

2.2 苯酚污染及修復(fù)對小麥幼苗Pn和Ci的影響

圖2 苯酚污染及修復(fù)對小麥幼苗光合特性指標(biāo)的影響

圖2可知，隨苯酚濃度的升高Pn呈顯著降低趨勢，Ci呈顯著上升趨勢；單施固定化菌株DF51時(shí)，隨固定化菌株DF51濃度的增加對Pn、Ci的影響均不顯著；同時(shí)施用苯酚和固定化菌株DF51時(shí)，隨固定化菌株DF51濃度的增加Pn、Ci呈不同程度的上升趨勢，處理之間差異極顯著.經(jīng)方差分析和Duncan新復(fù)極差法多重比較可知：苯酚和固定化菌株的交互作用對Pn的影響達(dá)到極顯著水平，對Ci影響不顯著.說明苯酚對小麥幼苗造成脅迫，使其葉片的光合速率降低；固定化菌株DF51可增加苯酚脅迫下小麥幼苗的Pn；不同的苯酚水平均以D4處理時(shí)CCI和Pn最大，且P1D4、P2D4處理與對照P0D0無顯著性差異，苯酚處理濃度越低Pn越大.這表明小麥幼苗光合速率降低的主要原因不是由于CO2供應(yīng)不足，而是由于葉肉細(xì)胞光合活性降低引起的碳氮代謝失調(diào)，同化力（即ATP和NADPH）供應(yīng)不足，限制了光合碳同化[9]；固定化菌株DF51可增強(qiáng)苯酚脅迫下小麥幼苗的光合特性，在P1D4、P2D4處理下可恢復(fù)到正常水平.

2.3 苯酚污染及修復(fù)對小麥幼苗S O D活性的影響

SOD活性高低可反映植株自身清除有害物質(zhì)能力的強(qiáng)弱.由圖2可知，SOD活性隨苯酚濃度的升高呈顯著下降趨勢，單施固定化菌株DF51時(shí)，隨固定化菌株DF51濃度的增加對SOD的影響不顯著；同時(shí)施用苯酚和固定化菌株DF51時(shí)，隨固定化菌株DF51濃度的增加SOD呈不同程度的上升趨勢，處理之間差異極顯著.表明苯酚對小麥幼苗的SOD活性具抑制作用，固定化菌株DF51可使小麥幼苗的的抗逆性增高，以抵抗不良外界環(huán)境條件.

2.4 苯酚污染及修復(fù)對小麥幼苗P O D活性的影響

過氧化物酶（POD）是植物抗逆性活性較高的一種酶，其具有雙重作用.它既與光合作用、呼吸作用、生長素的氧化等密切相關(guān)，同時(shí)又與清除細(xì)胞內(nèi)的H2O2，解除植物逆境脅迫時(shí)產(chǎn)生的活性氧傷害有密切關(guān)系.研究表明，POD活性對環(huán)境因子的變化相當(dāng)敏感，植物在遭受逆境（如水分、農(nóng)藥、鹽等逆境）時(shí)，POD活性與同工酶都會作出快速反應(yīng)[10，11].圖2看出，單施苯酚（D0水平）時(shí)，隨苯酚濃度的升高POD值呈先增高后降低的趨勢，P2處達(dá)到峰值.這是因?yàn)樾←滙w內(nèi)的POD酶可通過提升活力來抵御低濃度苯酚脅迫（P1、P2）對其產(chǎn)生的危害，但隨著苯酚濃度的增加，POD活力開始下降，低于對照，這可能是脅迫加重超過了POD的調(diào)節(jié)能力，此時(shí)小麥幼苗已受到氧化損傷.單施固定化菌株DF51時(shí)，隨固定化菌株DF51濃度的增加對POD的影響均不顯著.同時(shí)施用苯酚和固定化菌株DF51時(shí)，隨固定化菌株DF51濃度的升高POD值呈增高趨勢；D2、D3、D4水平時(shí)隨苯酚濃度的升高POD值呈上升趨勢，而D1水平時(shí)隨苯酚濃度的升高POD值呈先增高后降低的趨勢，P3處達(dá)到峰值，處理之間差異極顯著，這是由于低濃度的固定化菌株DF51（D1水平）對土壤中苯酚的去除率較低，因此不能提高P4水平脅迫時(shí)POD的活性，導(dǎo)致小麥幼苗受到氧化損傷.表明固定化菌株DF51可通過增加小麥幼苗的抗氧化酶活性來增強(qiáng)其對低濃度苯酚脅迫的耐性.

圖3 苯酚污染及修復(fù)對小麥幼苗SOD活性的影響

3 討論與結(jié)論

苯酚降解菌DF51的降解作用是清除環(huán)境中有機(jī)污染物苯酚的有效途徑之一.本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，固定化菌株DF51可降解土壤中的苯酚.本實(shí)驗(yàn)表明固定化菌株DF51對苯酚脅迫下的小麥幼苗的生長和生理特性影響顯著，在生產(chǎn)實(shí)踐中施用固定化菌株DF51可預(yù)防和補(bǔ)救小麥植株在苯酚脅迫下受損，促進(jìn)葉片制造更多的光合產(chǎn)物，增強(qiáng)小麥生產(chǎn)的安全性.

固定化菌株DF51對小麥幼苗的抗逆性指標(biāo)影響顯著，提高了小麥幼苗在苯酚脅迫下SOD、POD的活性，從而使自身抗逆性提高，同時(shí)促進(jìn)了小麥的光合作用.單施苯酚處理時(shí)，顯著降低了小麥的光合特性；超氧化物歧化酶活性呈降低趨勢、過氧化物酶活性呈先上升后下降趨勢，P2處為高峰.同時(shí)施用苯酚和固定化菌株DF51時(shí)，固定化菌株DF51可去除土壤中的苯酚，提高的小麥光合特性（CCI、Pn增加）和抗逆性（SOD、POD活性增加）.但在高濃度苯酚污染區(qū)施用低濃度的固定化菌株DF51處理（P4D1處理）的小麥有不結(jié)籽現(xiàn)象.固定化菌株DF51能顯著提高小麥幼苗在苯酚脅迫下的耐性，提高幼苗Pn，促進(jìn)植株生長，這些效應(yīng)與其提高抗氧化酶活性有關(guān).固定化菌株DF51的施藥模式可修復(fù)苯酚污染的大田，可用作苯酚污染土壤的修復(fù)途徑.

圖4 苯酚污染及修復(fù)對小麥幼苗POD活性的影響

根據(jù)Farquhar等[9]的觀點(diǎn)，當(dāng)氣孔導(dǎo)度與Ci同時(shí)下降時(shí)，光合速率下降主要是由氣孔限制引起的，Pn降低伴隨Ci的升高時(shí)，光合作用的主要限制因素是非氣孔因素.據(jù)此推斷，本試驗(yàn)條件下Pn的降低是由非氣孔因素引起的，也就是光合碳同化力不足，碳氮代謝失調(diào)引起的.這可能是葉肉細(xì)胞光合活性的下降造成的，如葉綠素含量降低、光合羧化酶Rubisco活性下降、光合電子傳遞活性降低等，具體原因和內(nèi)在機(jī)理還有待進(jìn)一步的研究.

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