雷帕霉素減緩大鼠被動Heymann腎炎的進(jìn)展*

楊鳳杰， 周建華， 呂倩影， 蒲金赟， 張 瑜

膜性腎病(membranous nephropathy，MN)是原發(fā)性腎病綜合征的主要病理類型之一。其臨床表現(xiàn)輕重不一，預(yù)后差別較大，雖然部分患者可自發(fā)緩解，但近半數(shù)患者最終進(jìn)展至終末期腎臟病，且停藥后復(fù)發(fā)率高［1］。因此，對于MN的治療一直存在較大爭議，至今尚無十分有效的治療方案。大鼠被動Heymann腎炎(passive Heymann nephritis，PHN)的病理變化與人類MN非常相似，被視為最經(jīng)典的MN模型。近年來，來自人類和動物模型的大量研究均顯示，細(xì)胞自噬與多種腎臟疾病的進(jìn)展及預(yù)后密切相關(guān)，如足細(xì)胞?。?-3］、IgA 腎?。?］、糖尿病腎?。?］、自身免疫性腎臟?。?］、中毒性腎損傷［7］等。而雷帕霉素不僅是一種免疫抑制劑，同時也是一種自噬反應(yīng)增強劑。因此，本研究通過觀察雷帕霉素對PHN大鼠的蛋白尿水平、腎臟病理改變及足細(xì)胞病變等的影響，來證實我們提出的假說“雷帕霉素可能通過增強自噬而減緩MN進(jìn)展”。

材料和方法

1 分組與大鼠PHN模型的建立

體重(180±5)g的SPF級雄性SD大鼠(北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司)，SPF級標(biāo)準(zhǔn)適應(yīng)性喂養(yǎng)2 d。按隨機數(shù)字表法分成對照組、PHN模型組和雷帕霉素治療組，每組各8只。PHN模型組以5 mL/kg劑量靜脈注射第1劑羊抗Fx1A抗體(Probetex)［8］，次日再以 3 mL/kg劑量靜脈注射第 2劑Fx1A抗體加強免疫，對照組同期注射等量生理鹽水。雷帕霉素組是在PHN模型基礎(chǔ)上，腹腔注射1 mg/kg的雷帕霉素(LC Laboratories)，連續(xù)注射21 d，對照組和PHN組則同期注射等量生理鹽水。

2 主要方法

2.1 尿蛋白、血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)和血清肌酐(serum creatinine，SCr)檢測以及腎組織病理分析 于觀察結(jié)點前1 d收集大鼠24 h尿液，測定24 h尿蛋白。于觀察結(jié)點當(dāng)天處死動物，留取血樣，測定BUN和SCr。留取腎組織做病理形態(tài)學(xué)觀察［過碘酸-六次甲基四胺銀(periodic acid-silver methenamine，PASM)染色］。

2.2 組織免疫熒光染色 冰凍切片室溫晾干15 min，PBS 浸洗 10 min，10%山羊血清封閉 60 min，吸干封閉液，滴加小鼠抗大鼠C5b-9單抗(Santa Cruz)4℃孵育過夜，PBS洗片3次，滴加FITC標(biāo)記的羊抗小鼠IgGⅡ抗(武漢博士德生物公司)37℃孵育60 min，PBS洗片3次，封片后熒光顯微鏡下觀察、攝像。

2.3 腎小球足細(xì)胞計數(shù) 由于腎小球內(nèi)僅足細(xì)胞核有WT1的表達(dá)，本文采用免疫組織化學(xué)方法(En-Vision二步法)對大鼠足細(xì)胞進(jìn)行特異性染色。石蠟切片脫蠟至水，于檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)中進(jìn)行微波抗原修復(fù)處理，室溫自然冷卻，PBS洗片，滴加3%H2O2室溫孵育10 min，PBS洗片，正常羊血清37℃封閉1 h，滴加抗WT1多克隆抗體(Bioworld)4℃孵育過夜，次日37℃復(fù)溫1 h，PBS洗片，滴加EnVision酶標(biāo)抗兔/鼠聚合物，37℃孵育30 min，PBS洗片，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水透明后中性樹脂封片，觀察。以PBS取代Ⅰ抗作為陰性對照。采用HPIAS-1000彩色病理圖文分析軟件在Olympus BX60顯微鏡高倍視野下采集圖像，每只大鼠選取10個以上非重復(fù)非硬化的腎小球，參照文獻(xiàn)［9-10］采用Weibel-Gomez方法，進(jìn)行圖像處理分析，并計數(shù)單個腎小球體積(V，×10-3mm3)、足細(xì)胞相對密度(Nv，×103mm-3)及單位腎小球足細(xì)胞絕對數(shù)目(Npodo)。每只大鼠檢測≥10個非重復(fù)非硬化的腎小球，并取其平均值。

2.4 免疫組織化學(xué)染色 采用EnVision法對大鼠腎組織切片行caspase-3特異性染色。步驟同4，Ⅰ抗為兔抗大鼠caspase-3抗體(武漢博士德生物公司)。結(jié)果判定:細(xì)胞漿或(和)細(xì)胞核呈棕黃色為caspase-3陽性反應(yīng)，本研究將細(xì)胞核呈棕黃色者計為活性caspase-3陽性細(xì)胞，即凋亡細(xì)胞，見圖4。高倍鏡下，每只大鼠隨機觀察10個非重復(fù)非硬化腎小球，計算單個腎小球內(nèi)活性caspase-3陽性細(xì)胞比例(陽性細(xì)胞數(shù)/有核細(xì)胞總數(shù))，取其平均值。

2.5 Western blotting檢測 大鼠腎臟離體后迅速保存于液氮罐中，按文獻(xiàn)［11］的方法分離獲取腎小球，加入細(xì)胞裂解液和蛋白酶抑制劑冰上超聲3 s×5次，冰上裂解30 min，而后12 000 r/min、4℃離心15 min，取上清，測蛋白濃度，熱處理變性。取40 μg總蛋白經(jīng)12%SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉，Ⅰ抗4℃孵育過夜，TBST緩沖液洗膜，HRP標(biāo)記的Ⅱ抗孵育，TBST洗膜，電化學(xué)發(fā)光法顯影，通過凝膠成像系統(tǒng)定量分析。以GAPDH為內(nèi)參照。Ⅰ抗為兔抗大鼠 LC3抗體(Cell Signaling Technology)。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間比較采用單因素方差分析，應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件處理，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 雷帕霉素對PHN模型鼠體重、尿蛋白排泄量及腎功能的影響

如表1所示，在第21天時，雷帕霉素治療組大鼠的平均體重明顯低于對照組和PHN模型組(P＜0.05)，但在藥物治療期間大鼠的健康狀況并未受影響，3組大鼠均無中途死亡。PHN模型組24 h尿蛋白排出量明顯高于對照組(P＜0.05)，而雷帕霉素治療組的尿蛋白排出量明顯低于PHN模型組(P＜0.05)，表明雷帕霉素可減輕PHN模型鼠的蛋白尿水平。各組大鼠血清BUN和SCr無顯著差異。

表1 雷帕霉素對PHN模型鼠體重、尿蛋白排泄量及腎功能的影響Table 1.The effect of rapamycin on rat weight，proteinuria and renal functions(Mean±SD.n=8)

2 雷帕霉素對PHN模型C5b-9沉積的影響

免疫熒光染色顯示，PHN模型組和雷帕霉素治療組大鼠的腎小球內(nèi)可觀察到膜攻擊復(fù)合物C5b-9沿基底膜呈線狀沉積，2組之間沒有明顯差異，而對照組未見C5b-9顯色，表明雷帕霉素不影響C5b-9的沉積，見圖1。

Figure 1.Effect of rapamycin on C5b-9 deposition in glomeruli of PHN rats(immunofluorescence staining，×400).A:control;B:PHN;C:PHN+rapamycin.圖1 C5b-9在大鼠腎小球基底膜的沉積

3 雷帕霉素對PHN大鼠腎臟病變的影響

PASM染色顯示，PHN模型組和雷帕霉素治療組大鼠均有局灶節(jié)段性腎小球基底膜增厚，部分節(jié)段基底膜上皮側(cè)可見釘突形成，但雷帕霉素組基底膜增厚的程度和范圍較PHN模型組有所減輕;而對照組大鼠的腎小球毛細(xì)血管腔開放良好，系膜細(xì)胞及基質(zhì)無明顯增生，腎小球基底膜無增厚，見圖2。

Figure 2. The sections of the kidneys with PASM staining(×400).A:control;B:PHN;C:PHN+rapamycin.圖2 各組大鼠腎組織病理改變

4 雷帕霉素對PHN大鼠腎小球足細(xì)胞數(shù)量的影響

WT1抗原特異性表達(dá)于腎小球足細(xì)胞的胞核，腎小球內(nèi)其它細(xì)胞及腎小管上皮均未見其表達(dá)，藉此標(biāo)記可準(zhǔn)確地評估腎小球足細(xì)胞數(shù)量。如圖3所示，與對照組相比，PHN模型組大鼠的單位腎小球足細(xì)胞絕對數(shù)目顯著下降，但單個腎小球毛細(xì)血管簇平均體積無明顯改變，提示在該病理狀態(tài)下存在足細(xì)胞缺失;而雷帕霉素治療組大鼠的足細(xì)胞缺失情況較PHN模型組有所改善。

Figure 3.Podocyte number per glomerulus estimated using Weibel-Gomez methods(immunohistochemical staining for WT1，×400).Mean±SD.n=8.*P＜0.05 vs control group.圖3 足細(xì)胞數(shù)量的變化

5 雷帕霉素對PHN大鼠腎小球內(nèi)caspase-3表達(dá)的影響

PHN模型鼠腎小球內(nèi)均可見caspase-3表達(dá)，并且大多見于足細(xì)胞胞核區(qū)(即凋亡細(xì)胞)，雷帕霉素治療組大鼠的腎小球內(nèi)活性caspase-3陽性細(xì)胞比例較PHN模型組明顯減少，而在正常對照組，腎小球內(nèi)未見caspase-3表達(dá)，見圖4。

Figure 4.Immunohistochemistry for caspase-3(×400).The arrow indicates podocyte apoptosis.A:control;B:PHN;C:PHN+rapamycin.圖4 腎小球內(nèi)細(xì)胞凋亡的檢測

6 各組大鼠腎小球內(nèi)細(xì)胞自噬的檢測

如圖5所示，與對照組相比，PHN大鼠腎小球內(nèi)自噬標(biāo)志物L(fēng)C3-Ⅱ表達(dá)明顯增強，而雷帕霉素治療組大鼠的LC3-Ⅱ表達(dá)水平又顯著高于PHN模型組和對照組。

Figure 5.Western blotting for LC3 expression in the glomerulus.A:control;B:PHN;C:PHN+rapamycin.Mean±SD.n=8.*P＜0.05 vs control group;△P＜0.05 vs PHN group.圖5 各組大鼠腎小球內(nèi)細(xì)胞自噬的檢測

討 論

1963年De Duve首次提出“細(xì)胞自噬”這個生物學(xué)概念，它是廣泛存在于真核細(xì)胞的一種溶酶體依賴的降解途徑，主要調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)長壽命蛋白和細(xì)胞器的降解，使降解產(chǎn)物被細(xì)胞再利用，因此，其在細(xì)胞發(fā)育、損傷修復(fù)、組織重塑及適應(yīng)性應(yīng)答等方面發(fā)揮著極為關(guān)鍵的作用。它是一個嚴(yán)格調(diào)控的程序性過程:首先，在胞漿中形成一個來源于粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或高爾基體的扁平雙層膜結(jié)構(gòu)，而后不斷擴張，稱之為“前自噬泡”;前自噬泡不斷延伸，將胞漿中廢棄組分?jǐn)埲肫渲?，而后邊緣融合，形成密閉的球形雙層膜結(jié)構(gòu)，稱之為“自噬體”;隨后，在細(xì)胞骨架蛋白驅(qū)動下自噬體與溶酶體融合，形成“自噬溶酶體”，以降解其內(nèi)容物及雙層膜結(jié)構(gòu)［12］。迄今為止，許多研究已證實自噬在足細(xì)胞病、腎臟缺血-再灌注損傷、糖尿病腎病等腎臟疾病中發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞修復(fù)、阻止細(xì)胞凋亡等保護(hù)性作用［13］。本研究發(fā)現(xiàn)，PHN模型組(造模后第21天)大鼠腎小球內(nèi)LC3-II的表達(dá)水平較對照組顯著升高，可見，在PHN病變過程中存在腎小球固有細(xì)胞的自噬反應(yīng)活化。但在此病理狀態(tài)下，自噬是否發(fā)揮保護(hù)性作用仍需進(jìn)一步證實。

為研究自噬在PHN病變過程中所充當(dāng)?shù)慕巧?，我們選用雷帕霉素作為自噬增強劑對模型鼠進(jìn)行干預(yù)。雷帕霉素，又名西羅莫司，是從鏈球菌中提取的一種大環(huán)內(nèi)酯類藥物，具有免疫抑制、抗腫瘤、抗真菌等作用，其作用靶點是哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)。mTOR 通路廣泛存在于哺乳動物細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)，主要功能是依據(jù)細(xì)胞的不同狀態(tài)調(diào)節(jié)其增殖與分化，對細(xì)胞自噬、合成分解代謝、核糖體形成等也均有調(diào)控作用。mTOR分為mTORC1和mTORC2兩條通路，前者為雷帕霉素敏感性通路，對細(xì)胞自噬有負(fù)向調(diào)控作用，后者為雷帕霉素非敏感性通路，與細(xì)胞骨架蛋白形成及延展相關(guān)。雷帕霉素與FKBP-12形成復(fù)合體后與mTORC1中的mTOR調(diào)控相關(guān)蛋白相結(jié)合，從而抑制mTORC1，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬。本研究顯示，造模后即給予雷帕霉素治療，可顯著緩解PHN模型鼠的蛋白尿，同時腎組織PASM染色也顯示雷帕霉素組大鼠腎小球基底膜的病變較PHN模型組有所減輕。表明在PHN病變過程中，腎小球內(nèi)固有細(xì)胞的自噬反應(yīng)起著保護(hù)性作用，而適當(dāng)增強自噬可在一定程度上緩解病變。

膜性腎病的主要病理特征為腎小球基底膜足細(xì)胞下大量免疫復(fù)合物沉積伴基底膜彌漫增厚，可見，病變主要位于腎小球毛細(xì)血管袢，而足細(xì)胞病變?yōu)槠渥钔怀霰憩F(xiàn)，因此，近年來MN被認(rèn)為是一種“足細(xì)胞病”。我們長期的臨床病理觀察也發(fā)現(xiàn)，所有MN患兒均存在不同程度的足細(xì)胞病變，包括足突融合、足突微絨毛化、足細(xì)胞腫脹、足細(xì)胞空泡變性、足細(xì)胞崩解等［10］。足細(xì)胞，是一種類似于神經(jīng)元的多突狀高度分化細(xì)胞，在體內(nèi)其分裂增殖能力有限，一旦受損很難再生修復(fù)。不少研究表明足細(xì)胞損傷乃至缺失是促進(jìn)腎小球硬化的重要因素之一［14-15］。本研究觀察到，與正常大鼠相比，PHN模型鼠存在足細(xì)胞缺失現(xiàn)象，并且這種缺失與足細(xì)胞凋亡相關(guān)，而造模后即給予雷帕霉素治療可在一定程度上改善足細(xì)胞缺失，減少凋亡。從而提示在PHN病變過程中，適當(dāng)增強自噬水平可有效減少足細(xì)胞凋亡，延緩腎臟病變惡化進(jìn)展。

綜上所述，我們認(rèn)為，在PHN的病變過程中，適當(dāng)強度的自噬發(fā)揮著保護(hù)性作用。一定程度地增強自噬，減少足細(xì)胞凋亡，進(jìn)而減輕腎臟病變和緩解蛋白尿，是雷帕霉素減緩大鼠PHN進(jìn)展的重要機制之一。雖然PHN模型的間質(zhì)損傷較人類MN明顯，未必能詮釋MN的整個病變過程，但其21 d以內(nèi)的病程與人類MN極為類似，因此，本研究仍可提示雷帕霉素可能通過增強自噬的機制延緩膜性腎病的惡化進(jìn)展。

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