轉(zhuǎn)化生長因子TGF－β1+869T/C基因多態(tài)性與子癇前期的相關(guān)性研究

廖志瓊 甘 婷 陳晞明 吳愛華 廖德貴 陳盛強(qiáng) 肖國宏 方朝輝

迄今為止，子癇前期(Pre－Eclampsia)仍是孕產(chǎn)婦及圍產(chǎn)兒死亡的重要原因之一。子癇前期的發(fā)病原因尚不十分清楚，可能發(fā)病機(jī)制主要包括遺傳缺陷、胎盤微環(huán)境的損傷和免疫異常等［1－4］。三種機(jī)制在不同患者中單獨(dú)或聯(lián)合作用，導(dǎo)致胎盤功能異常，其中免疫和遺傳學(xué)病因越來越引起人們的重視。TGF－β1廣泛參與哺乳類動(dòng)物的各種生理過程。在機(jī)體免疫系統(tǒng)中TGF－β1又是一個(gè)重要的免疫調(diào)節(jié)因子，參與維持自身免疫耐受和T細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。近年來研究發(fā)現(xiàn)TGF－β1是一種多功能的細(xì)胞因子，TGF－β1表達(dá)水平異常與某些疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。有研究表明，適量的TGF－β1對(duì)胎兒生長發(fā)育是必需的。蛻膜和滋養(yǎng)細(xì)胞中TGF－β1的合成與分泌在胎盤發(fā)育和胚胎生長中起著重要作用［5－7］。而 TGF－β1表達(dá)異?？梢允棺甜B(yǎng)細(xì)胞向子宮內(nèi)層浸潤受限，子宮胎盤血流減少，致使滋養(yǎng)細(xì)胞淺植入和子宮胎盤血管的異常高阻抗，形成子癇前期的病理生理改變，導(dǎo)致子癇前期的發(fā)生［8］。TGF－β1表達(dá)異常與子癇前期發(fā)生可能涉及了十分復(fù)雜的分子調(diào)控機(jī)制［9］。TGF－β1存在基因多態(tài)性，國內(nèi)外的研究顯示TGF－β1基因多態(tài)性和特定基因型是疾病的危險(xiǎn)因素［10－12］，TGF－β1基因多態(tài)性是通過何種機(jī)制導(dǎo)致子癇前期的發(fā)生，目前仍不清楚。由于該基因在不同地域和種族之間存在較大基因多態(tài)及基因型差異。我們對(duì)轉(zhuǎn)化生長因子TGF－β1+869T/C基因多態(tài)性與子癇前期的相關(guān)性進(jìn)行了探討，為子癇前期的預(yù)測(cè)和預(yù)防提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇2010年10月～2011年12月期間在廣州醫(yī)科大學(xué)第二、第三附屬醫(yī)院產(chǎn)科住院的156例子癇前期患者作為研究對(duì)象，臨床診斷均符合樂杰主編《婦產(chǎn)科學(xué)》(第7版)中的標(biāo)準(zhǔn)［13］;另選擇同期在上述兩院產(chǎn)科正常分娩的足月妊娠孕婦252例作為對(duì)照組。剔除妊娠期間發(fā)生內(nèi)科合并癥和產(chǎn)科并發(fā)癥的病例，兩組研究對(duì)象孕前均無高血壓、心臟病、腎病、糖尿病、血小板減少等病史。兩組孕婦的一般臨床資料如表1所示，兩組孕婦的年齡、孕周比較沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05);子癇前期組孕婦早產(chǎn)和剖宮產(chǎn)的發(fā)生率均明顯高于對(duì)照組(p＜0.05)，而胎盤重量和新生兒體重則明顯低于對(duì)照組(p＜0.01)。

表1 子癇前期組和對(duì)照組孕婦的一般臨床資料比較 (%)

1.2 樣本采集

所有研究對(duì)象均于清晨空腹采集靜脈血3.0 ml，置EDTA－K2抗凝無菌真空管中混勻，離心分離血漿，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 主要試劑

TaqDNA聚合酶和dNTP由鼎國生物技術(shù)公司提供，Pst Ι內(nèi)切酶由寶生生物工程(大連)有限公司提供。引物由賽百盛有限公司合成，根據(jù)參考文獻(xiàn)［14］提供的引物序列:

上游引物5'－CAGACTCTAGAGACTGTCAG－3'，

下游引物5'－GTCACCAGAGAAAGAGGAC－3'。

1.4 DNA 模板制備

采用Gentra公司的試劑盒，抽提標(biāo)本基因組DNA模板。

1.5 擴(kuò)增 TGF－β1+869T/C

PCR 反應(yīng)體系總體積為 30 μl，模板 DNA 1 μl(約1 μg)，10 × 緩沖液 3 μl，Taq 酶 1 μl(約 1 U)，25 mm ×MgCl21 μl，引物分別 為 1 μl(20 pmol)，dNTP 1 μl(100 μmol/L)，用雙蒸水補(bǔ)足至 30 μl。PCR 擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性5 min，然后以下列溫度和時(shí)間循環(huán)30次:94℃ 45 s、58℃ 45 s、72℃ 45 s。末次循環(huán)后繼續(xù)于72℃延伸7 min，PCR擴(kuò)增反應(yīng)完畢。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物15 μl用 Pst Ι內(nèi)切酶 0.5 μl(10 U/μl)，10 × 緩沖液 2 μl，用雙蒸水補(bǔ)足至20 μl?；靹?，5 000 r/min離心2 min后，37℃水浴過夜。取酶切產(chǎn)物在3%瓊脂糖凝膠板于0.5×TBE電泳緩沖液電泳檢測(cè)酶切結(jié)果(106 V，35 min)，紫外反射投射儀觀察結(jié)果并拍照。

1.6 DNA序列測(cè)定法驗(yàn)證酶切法檢出的 TGF－β1+869T/C基因型

從用酶切法已鑒定出基因型的標(biāo)本中隨機(jī)抽取10例，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后，按標(biāo)準(zhǔn)程序在ABI 3100全自動(dòng)序列分析儀上進(jìn)行雙向測(cè)序并分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，一般臨床資料的組間比較采用t檢驗(yàn);計(jì)算基因的等位基因頻率、基因型頻率、基因多態(tài)性與疾病的相關(guān)性及相對(duì)危險(xiǎn)度，組間比較用χ2檢驗(yàn)，表達(dá)強(qiáng)度用等級(jí)資料秩和檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 目的基因片段擴(kuò)增

采用TGF－β1+869T/C位點(diǎn)特異性引物經(jīng)PCR擴(kuò)增后，得到大小約110 bp的基因片段，與目的基因片段大小相符。

2.2 TGF－β1+869T/C等位基因的指定

將擴(kuò)增片段做RFLP分析，經(jīng)PstⅠ酶切后可產(chǎn)生3種酶切類型:①TGFβ1+869 CC純合子基因型，可被酶切為86 bp和24 bp兩個(gè)片段;② TGFβ1+869 TT突變純合子基因型，因發(fā)生了PstⅠ酶切位點(diǎn)的突變而不被酶切，電泳后只出現(xiàn)110 bp條帶;③ TGFβ1+869 TC雜合子基因型，經(jīng)PstⅠ內(nèi)切酶消化后產(chǎn)生部分酶切，可出現(xiàn)86 bp、24 bp和110 bp三個(gè)條帶。TGFβ1+869T/C基因位點(diǎn)多態(tài)性分析結(jié)果見圖1。

將上述三種基因型的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DNA序列測(cè)定，結(jié)果見圖2:①TGFβ1+869 CC純合子基因型的序列為:GCTGCCGCA;② TGFβ1+869 TT突變純合子基因型的序列為:GCTGCTGCA;③ TGF－β1+869 CT雜合子基因型的序列為:GCTGCC/TGCA。限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性分析與DNA測(cè)序的結(jié)果是一致的。

圖1 TGF－β1+869T/C位點(diǎn)基因型PCR－RFLP分析電泳圖

圖2 TGF－β1+869T/C位點(diǎn)各基因型測(cè)序圖

2.3 子癇前期組與對(duì)照組孕婦TGF－β1+869T/C基因型與等位基因頻率的分布

TGF－β1基因+869T/C位點(diǎn)存在CC、CT、TT三種基因型，子癇前期組CC基因型占33.33%(52/156)，CT基因型占62.18%(97/156)，TT基因型占4.49%(7/156);對(duì)照組 CC基因型占 13.10%(33/252)，CT基因型占48.41%(122/252)，TT基因型占38.49%(97/252)。子癇前期組孕婦CC基因型頻率明顯高于對(duì)照組，RR=1.803，95%CI為1.214 ～2.713，χ2=23.93，p＜0.01;CT基因型頻率也明顯高于對(duì)照組，相對(duì)危險(xiǎn)系數(shù)RR=1.852，95% 可信區(qū)間(95%CI)為 1.251 ～2.821，χ2=7.34，p＜0.01;而TT基因型頻率則明顯低于對(duì)照組，RR=0.119，95%CI為0.0814 ～0.286，χ2=58.66，p＜0.01。子癇前期組孕婦外周血TGF－β1+869T/C位點(diǎn)C等位基因頻率(64.42%)明顯高于對(duì)照組(37.30%)，T等位基因頻率(35.58%)明顯低于對(duì)照組(62.70%)，χ2=56.82，p＜0.01，相對(duì)危險(xiǎn)系數(shù)RR=3.044，95%可信區(qū)間(95%CI)為1.563 ～4.821，結(jié)果見表2。

表2 子癇前期組與對(duì)照組TGF－β1+869T/C位點(diǎn)基因型和等位基因頻率的分布

2.4 群體代表性檢驗(yàn)

子癇前期組和對(duì)照組TGF－β1+869T/C基因型分布經(jīng)χ2檢驗(yàn)p＞0.05，符合Hardy－Weinbern平衡定律，這表明兩組研究對(duì)象來自同一群體。

3 討論

TGF－β1是一種多功能的生物活性生長因子，其在細(xì)胞分化活躍的組織中含量較高，可對(duì)眾多的組織器官產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)。具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化、抑制炎癥、促進(jìn)組織修復(fù)和胚胎發(fā)育等功能。TGF－β1可能還參與了機(jī)體血壓的調(diào)節(jié)，有研究發(fā)現(xiàn)高血壓患者外周血中TGF－β1濃度與血壓水平呈正相關(guān)［14］，認(rèn)為TGF－β1的升高可能與其對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用相關(guān)，內(nèi)皮素(Endothelin，ET)被認(rèn)為是迄今最有效的縮血管多肽，TGF－β1高表達(dá)后可能刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的內(nèi)皮素mRNA表達(dá)，使內(nèi)皮素增多，血管平滑肌收縮，血壓升高［15－16］，TGF － β1 也可能促進(jìn)腎臟釋放腎素，使血管緊張素II升高，導(dǎo)致腎素－血管緊張素－醛固酮系統(tǒng)失衡，使血壓升高，產(chǎn)生高血壓的一系列臨床癥狀。

2000年后，隨著人類基因組計(jì)劃的完成，有關(guān)基因結(jié)構(gòu)和功能的研究進(jìn)展迅速，基因多態(tài)性與疾病易感性的研究越來越引人關(guān)注，成為研究的熱點(diǎn)。其中TGF－β1基因多態(tài)性與疾病相關(guān)性的研究也取得了令人鼓舞的成果。有研究報(bào)道 TGF－β1－509C/T、+869T/C及 +915G/C基因位點(diǎn)多態(tài)性可能與原發(fā)性高血壓發(fā)病相關(guān)［14］。

目前認(rèn)為，子癇前期的遺傳因素是由若干作用微小但有累積效應(yīng)的致病基因構(gòu)成。個(gè)體攜帶的基因型可能影響疾病的易患性和疾病的程度。迄今為止，子癇前期易感基因尚不清楚。研究子癇前期易感基因?qū)ψ影B前期的預(yù)測(cè)與預(yù)防具有重要意義與價(jià)值［17］。人的TGF－β1基因定位于19q13，其mRNA前體由7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子組成，具有8個(gè)常見基因多態(tài)性位點(diǎn)。其中3個(gè)位于TGF－β1基因5’末端啟動(dòng)子區(qū)域 (－988C/A、－800G/A、－509C/T)，3個(gè)位于編碼區(qū)(包括第1外顯子區(qū)+869T/C、+915G/C和第5外顯子區(qū)+788C/T位點(diǎn))，有2個(gè)是codon位點(diǎn)，分別為codon263和 codon327。其中+869T/C和+915G/C基因多態(tài)性位點(diǎn)位于第1外顯子編碼的信號(hào)肽蛋白序列中。TGF－β1基因的變異可導(dǎo)致其表達(dá)和功能異常，從而誘導(dǎo)多種疾病的發(fā)生。TGF－β1基因特定的單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)位點(diǎn)的基因型可能可以作為個(gè)體遺傳特性的標(biāo)記，參與相關(guān)疾病的發(fā)生。

子癇前期是由遺傳、環(huán)境及免疫等諸多因素共同作用的臨床常見病和多發(fā)病。TGF－β1是一種多功能的細(xì)胞因子，最近研究表明，它可調(diào)節(jié)血脂水平，參與炎癥過程，而且發(fā)現(xiàn)它及其受體在動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)纖維斑塊和纖維脂肪性損傷區(qū)中呈現(xiàn)高水平表達(dá)，提示TGF－β1在AS的發(fā)病機(jī)制中可能發(fā)揮著重要作用，KANAE等［18］研究證實(shí)TGF－β1基因變異與AS明顯相關(guān)。而胎盤組織中的動(dòng)脈粥樣硬化是子癇前期的重要病理改變，提示TGF－β1的基因變異可能與子癇前期的易患性有關(guān)。

我們對(duì)廣東地區(qū)漢族人群中156例子癇前期患者和252例正常妊娠者進(jìn)行了TGF－β1基因多態(tài)性分析，研究結(jié)果顯示:TGF－β1+869T/C存在基因多態(tài)性。TGF－β1+869T/C位點(diǎn)由C和T兩種等位基因組成三種基因型，即TT型、CT型和CC型，+869T/C位點(diǎn)基因型分布和基因頻率在子癇前期患者與健康對(duì)照人群間存在顯著差異，CC/CT基因型發(fā)生子癇前期的危險(xiǎn)性顯著高于非攜帶者(p＜0.01)，C等位基因攜帶者發(fā)生子癇前期危險(xiǎn)性顯著高于T等位基因者(p＜0.01)，Logistic回歸分析顯示:C等位基因攜帶者發(fā)生子癇前期相對(duì)危險(xiǎn)性RR值為1.815，95% 可信區(qū)間(95%CI)為 1.214～2.713，提示TGF－β1+869T/C多態(tài)性位點(diǎn)CC/CT基因型和C等位基因與廣東地區(qū)漢族人群子癇前期發(fā)生的遺傳易感性相關(guān)。DE LIMA T H等［19］研究顯示－509C/T位點(diǎn)多態(tài)性與子癇前期發(fā)生相關(guān)，CT基因型和T等位基因攜帶者患子癇前期的危險(xiǎn)性增加，RR值為1.29。而KIM等［20］研究顯示TGF－β1－509T/C位點(diǎn)與子癇前期發(fā)生無相關(guān)性，而與+869T/C位點(diǎn)多態(tài)性相關(guān)。上述結(jié)果提示不同種族人群子癇前期的發(fā)生，可能與TGF－β1基因中不同的多態(tài)性位點(diǎn)及其不同的基因型或等位基因有關(guān)，說明基因多態(tài)性存在種族遺傳差異，不同種族和地區(qū)人群可能由不同的位點(diǎn)變異構(gòu)成子癇前期發(fā)生的危險(xiǎn)因素。TGF－β1+869T/C位點(diǎn)可能是中國廣東地區(qū)漢族人群子癇前期發(fā)生的危險(xiǎn)因子。

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