中藥注射液體外腎細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)的方法學(xué)探討

阮浩瀾等

[摘要] 目的 研究柴胡注射液和丹參注射液在犬腎近端小管上皮細(xì)胞（MDCK細(xì)胞）和人胚腎細(xì)胞（HEK-293細(xì)胞）模型的毒性作用，并探討中藥注射液體外腎細(xì)胞毒性檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)方法。 方法 選用馬兜鈴酸A作為陽(yáng)性對(duì)照，將不同廠(chǎng)家和批次的丹參注射液、柴胡注射液的原液及稀釋液，與MDCK細(xì)胞或HEK-293細(xì)胞共同孵育，通過(guò)四甲基偶氮唑鹽比色法（MTT法）量化細(xì)胞毒性，計(jì)算相對(duì)增殖率，進(jìn)行中藥注射液體外腎細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)。 結(jié)果 在MDCK細(xì)胞模型中，兩批丹參注射4個(gè)液稀釋濃度下毒性分級(jí)顯示為0級(jí)，一批稀釋9、27、81倍后顯示為0級(jí)，柴胡注射液稀釋27、81倍后顯示為0級(jí)；在HEK-293細(xì)胞模型中，一批丹參注射液4個(gè)稀釋濃度下毒性分級(jí)顯示為1級(jí)，一批稀釋9、27、81倍后顯示為1級(jí)，一批稀釋27、81倍后顯示為1級(jí)；柴胡注射液稀釋27、81倍后顯示為2級(jí)。 結(jié)論 利用腎臟細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞，可嘗試建立中藥注射液體外腎細(xì)胞毒性檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)方法。

[關(guān)鍵詞] 中藥注射液；腎；細(xì)胞毒性；四甲基偶氮唑鹽比色法

[中圖分類(lèi)號(hào)] R285.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2014）09（a）-0011-04

[Abstract] Objective To study the cytotoxicity of Salvia Injection and Bupleurum Injection in MDCK cells and HEK-293 cells and discuss the applicability of these experimental methods. Methods Aristolochic acid A was selected as a positive control drug. MDCK cells and HEK-293 cells were incubated with different concentrations of Salvia Injection or Bupleurum Injection. Then cytotoxicity was evaluated with MTT assay and relative growth rate （RGR） was calculated. Results In MDCK cell model， the RGR from two batches of Salvia Injection were shown as Class 0 after diluting 4 levels and one was shown as Class 0 after diluting 9， 27， 81 times. The RGR of Bupleurum Injection was shown as Class 0 after diluting 27， 81 times. Meanwhile， in HEK-293 cell model， the RGR from one batch of Salvia Injection was shown as Class 1 after diluting 4 levels. One batch of Salvia Injection was shown as Class 1 after diluting 9， 27， 81 times. One was shown as Class 1 after diluting 27， 81 times. The RGR of Bupleurum Injection was shown as Class 2 after diluting 27， 81 times. Conclusion The use of kidney-derived cells can help to establish experimental methods to test the Chinese medicine injection nephrotoxicity.

[Key words] Chinese medicine injection； Kidney； Cell toxicity； MTT assay

中藥所致的腎臟損害在世界范圍內(nèi)日益受到重視，目前顯示許多中藥具有腎毒性作用[1]，中藥腎毒性已經(jīng)嚴(yán)重制約了中藥在臨床上的使用。中藥注射液大部分都是經(jīng)血管給藥，其對(duì)腎臟損害的風(fēng)險(xiǎn)性更應(yīng)提高警惕，如穿心蓮內(nèi)酯注射液已發(fā)現(xiàn)可導(dǎo)致患者急性腎損害[2]。因此，建立一個(gè)快捷有效的中藥注射液腎毒性評(píng)價(jià)方法具有重要的意義。

目前體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)廣泛應(yīng)用于生物材料、醫(yī)療器械和藥品包裝材料的毒性研究[3-5]，可以對(duì)受試物潛在的細(xì)胞毒性進(jìn)行檢測(cè)。在中藥注射液方面，有研究選用小鼠成纖維細(xì)胞（L929細(xì)胞）進(jìn)行體外細(xì)胞毒性的分析[6-7]，但用腎臟來(lái)源的細(xì)胞進(jìn)行中藥注射液的腎毒性體外評(píng)價(jià)的研究少見(jiàn)報(bào)道。本研究選用來(lái)源于腎臟的犬腎近端小管上皮細(xì)胞（MDCK細(xì)胞）和人胚腎細(xì)胞（HEK-293細(xì)胞），參考中藥注射液在L929細(xì)胞毒性檢測(cè)的四甲基偶氮唑鹽比色法 （MTT法）[6]，考察中藥注射液對(duì)MDCK細(xì)胞和HEK-293細(xì)胞的體外細(xì)胞毒性作用，對(duì)建立基于MDCK細(xì)胞或HEK-293細(xì)胞的中藥注射液體外腎細(xì)胞毒性模型進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

柴胡注射液（廣東羅浮山國(guó)藥股份有限公司，批號(hào)L13C302），丹參注射液（廣東遠(yuǎn)大藥業(yè)有限公司，批號(hào)130501、130502、130503）。馬兜鈴酸A（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)110746-200406）。馬兜鈴酸A用二甲基亞砜（DMSO，終濃度為0.5%）溶解，配成100 μmol/mL儲(chǔ)存液。實(shí)驗(yàn)時(shí)，用DMEM培養(yǎng)液稀釋至實(shí)驗(yàn)濃度。DMEM培養(yǎng)液（GIBCO公司），胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司）。胰酶（吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司）。乳酸脫氫酶試劑盒（南京建成生物工程研究所）。其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?