產(chǎn)甘露聚糖酶細菌的分離鑒定、酶的部分純化及酶學性質(zhì)研究

吳華偉+蔚鑫鑫+陳雪秋

摘要：以魔芋粉為惟一碳源作為富集條件，利用剛果紅染色法從玉米地土壤中篩選到1株產(chǎn)β-甘露聚糖酶的菌株，經(jīng)搖瓶培養(yǎng)后其酶活力達到101 U/mL。經(jīng)形態(tài)觀察及16S rDNA序列分析，鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。利用硫酸銨分級沉淀、陰離子交換層析和疏水層析對酶進行了部分純化。對酶的酶學性質(zhì)研究發(fā)現(xiàn)，該酶的最適反應溫度為50 ℃，最適反應pH為5.0；在45～55 ℃時酶的穩(wěn)定性較好，保溫30 min后其殘留活性在80%以上，在pH4.5～5.5時酶的穩(wěn)定性較好，保持30 min后其殘留活性在80%以上。

關(guān)鍵詞：甘露聚糖酶；分離；鑒定；純化；酶學性質(zhì)

中圖分類號：S154.3；Q939 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）09-3601-05

Isolation， Identification， Partial Purification and Enzymatic Characterization of β-mannanase Producing Strain

WU Hua-wei， WEI Xin-xin， CHEN Xue-qiu

（College of Life Science， Yangtze University， Jingzhou 434025， Hubei，China）

Abstract： Using konjac powder as the sole carbon source， a strain producing β-mannanase was isolated from corn field with Congo red dyeing method and identified as Bacillus subtilis with morphological observation and 16S rDNA sequencing. After shaking- flask culture， the enzyme activity of this strain achieved 101 U/mL. By ammonium sulfate fractional precipitation， anion exchange chromatography and hydrophobic interaction chromatography， the enzyme was partly purified and studied on its enzymatic properties. The results showed that the optimal reaction temperature and pH of the produced β-mannanase were 50 ℃ and 5.0， respectively. The enzyme had a good stability under temperature from 45 to 55 ℃ and pH from 4.5 to 5.5， with the enzyme activity remained over 80% for 30 min.

Key words： β-mannanase；isolation； identification； purification；enzymatic properties

收稿日期：2014-01-10

基金項目：國家自然科學基金項目（31100076）

作者簡介：吳華偉（1977-），男，湖北宜昌人，副教授，博士，主要從事工業(yè)酶與微生物生物技術(shù)研究，（電話）13986734380（電子信箱）

wuhuawei-2000@163.com。

在自然界中，半纖維素的含量僅低于纖維素的含量，約占植物干重的25%～30%，是重要的可再生資源[1]。如果將半纖維素進行生物轉(zhuǎn)化生成簡單的糖類，再轉(zhuǎn)化成飼料、燃料、食品和化學制品等，對緩解全球的能源和食品危機、環(huán)境污染及飼料短缺等有極大意義[2]。β-甘露聚糖酶是屬于半纖維素水解酶類，是一種廣譜誘導型多功能酶，因其能夠以內(nèi)切的方式降解甘露聚糖、葡甘露聚糖和半乳甘露聚糖等中的β-1，4糖苷鍵而廣泛應用于食品、醫(yī)藥、飼料、紡織、造紙及石油開采等行業(yè)[3-5]。該酶廣泛存在于動物、植物和微生物中，但微生物產(chǎn)的β-甘露聚糖酶具有成本低、來源穩(wěn)定、容易提取、適用的pH和溫度范圍廣等優(yōu)點，因此是國內(nèi)外研究的熱點[6]。從20世紀70年代末開始對甘露聚糖酶和其產(chǎn)生菌進行研究，到目前為止已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了100多種產(chǎn)酶微生物，包括真菌、細菌和放線菌等[4]。不同來源的微生物產(chǎn)生的酶具有不同的性質(zhì)，大多數(shù)的產(chǎn)酶菌是從土壤中篩選[7]，現(xiàn)在也有學者從稻草堆肥[8]、工廠廢液[9]、植物內(nèi)生菌[10]和海洋環(huán)境[11]等篩選到產(chǎn)酶菌株。隨著對該酶研究的深入，研究重點已經(jīng)從最初的產(chǎn)酶菌株篩選、發(fā)酵條件優(yōu)化和酶的性質(zhì)等方面轉(zhuǎn)移到產(chǎn)酶基因的克隆和異源表達等方面[12]。目前，已有多個微生物來源的β-甘露聚糖酶實現(xiàn)了異源表達[1，4，13]。本試驗從玉米地、水稻地、棉花地表層土壤中分離產(chǎn)β-甘露糖酶的菌株，對菌株進行了鑒定，然后初步純化該酶，并對其酶學性質(zhì)進行分析，以期對該酶的工業(yè)化生產(chǎn)及應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

土樣采集：在長江大學試驗田進行土壤取樣，選取玉米地、水稻地、棉花地的表層土壤，采樣時用無菌刮鏟采集離地面5～25 cm處的土樣10～25 g，裝入事先準備好的塑料袋內(nèi)扎好，4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

培養(yǎng)基：①選擇性分離培養(yǎng)基：蛋白胨1 g，牛肉膏3 g，NaCl 5 g，魔芋粉10 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH7.0～7.2；②種子培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，NaCl 5 g， 蒸餾水1 000 mL。③發(fā)酵培養(yǎng)基：魔芋粉20 g，酵母膏5 g，NaNO3 5 g，K2HPO4 5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，蒸餾水1 000 mL。④牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：蛋白胨10 g， 牛肉膏3 g， NaCl 5 g， 瓊脂20 g， 蒸餾水1 000 mL。⑤LB固體培養(yǎng)基：酵母膏5 g ，蛋白胨10 g，葡萄糖10 g，NaCl 10 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH7.4。endprint

主要儀器：分光光度計（Unico）、高速冷凍離心機（Thermo IEC）、Delt320型pH計（梅特勒-托利多儀器公司）、AKTA Explorer 100蛋白純化系統(tǒng)（GE公司）

1.2 方法

1.2.1 β-甘露聚糖酶產(chǎn)生菌的篩選

1）初篩。稱取1 g樣品，進行10倍梯度稀釋，從10-4、10-5、10-6 3個稀釋度溶液中各吸取0.5 mL涂布于選擇性分離培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)2～3 d。對已長出菌落的平板用1 g/L剛果紅染色1 h，然后用1 mol/L NaCl脫色1 h。選擇水解圈直徑與菌落直徑的比值（H/C值）大的菌株在相應培養(yǎng)基上進一步劃線分離，直至得到純的單菌落，將純化后的單菌落進行編號，并接入到斜面種子培養(yǎng)基，用于后續(xù)復篩和鑒定。

2）復篩。將初篩選出的菌株接種于50 mL種子培養(yǎng)基，于37 ℃、180 r/min培養(yǎng)48 h后作為種子液。隨后取10 mL種子培養(yǎng)液加入50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，于37 ℃、180 r/min培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)結(jié)束后收集培養(yǎng)液并離心，上清液即為粗酶液，采用DNS法測定粗酶液中甘露聚糖酶活性。

3）酶活測定。以去除還原糖的魔芋粉[用濃度為85%～90%的乙醇按5∶1（g/mL）的比例浸提魔芋粉5次，每次浸提24 h，適當攪拌，浸提好后65 ℃烘干備用]配制成0.5%的溶液作底物[14]。在0.25 mL的底物中加入0.1 mL適當稀釋的酶液，在55 ℃下水浴30 min，加入0.75 mL DNS試劑，在沸水中煮沸5 min，冷卻后在波長為550 nm下測其吸光度。以有底物無酶作為空白對照。以D-甘露糖作為標準品制作標準曲線，根據(jù)標準曲線計算樣品中的還原糖含量。

在上述反應條件下，每分鐘釋放出相當于1μmol D-甘露糖的還原糖所需要的酶量為1個酶活力單位（U）。

1.2.2 菌株的鑒定

1）常規(guī)生理生化鑒定。通過形態(tài)學觀察、革蘭氏染色對所分離的甘露聚糖酶產(chǎn)生菌進行初步鑒定。

2）分子生物學方法鑒定。菌株基因組DNA的提取參照文獻[15]，采用16S rDNA通用引物F1（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）、F2（5′-AAGTCG

TAACAAGGTA-3′）擴增目的菌株的16S rDNA序列。PCR反應體系（50 μL）為：模版DNA 1μL，dNTP 4 μL，濃度為20 nmol/L的引物各1 μL，0.25 U/μL的ExTaq酶1 μL，10×buffer 5 μL，無菌雙蒸水37 μL，混勻。PCR反應條件：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性45 s，55 ℃復性30 s，72 ℃延伸90 s，30個循環(huán)； 72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳純化后與pMD18-T載體進行連接，然后轉(zhuǎn)化進大腸桿菌JM109，并測序。將所測定的序列提交到GenBank基因庫中，同時應用NCBI的BLAST進行同源性比對，選取同源性較高的典型菌株的16S rDNA序列作為參比對象，然后采用鄰接法，用MEGA 5.1構(gòu)建供試菌與參比菌之間的系統(tǒng)進化樹，確定菌株種屬。

1.2.3 酶的純化

1）粗酶液的制備。5 L發(fā)酵培養(yǎng)基以2%的接種量接種后，于37 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)13 h，發(fā)酵液經(jīng)5 000 r/min離心10 min，上清液即為粗酶液。

2）硫酸銨分級沉淀。取8支1.5 mL EP管各加入1 mL粗酶液，分別加固體硫酸銨至20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的飽和度，邊加邊振蕩以防止局部濃度過高使蛋白質(zhì)變性。4 ℃靜置8 h，10 000 r/min離心10 min，分別收集上清液和沉淀。將沉淀用10 mL pH8.5的20 mmol/L的Tris-HCl緩沖液溶解。測上清液和沉淀的酶活并根據(jù)相對活力分布和硫酸銨飽和度繪制出鹽析曲線圖。

3）DEAE-Sepharose FF陰離子交換柱層析。將上述收集的沉淀用pH8.5的20 mmol/L的Tris-HCl緩沖液溶解，然后于2 L Tris-HCl緩沖液（pH 8.5，20 mmol/L）中透析過夜，次日將透析過夜的酶液上樣到已經(jīng)用Tris-HCl緩沖液（pH8.5，20 mmol/L）平衡好的DEAE陰離子交換柱（規(guī)格：1.6 cm×20 cm）中。以含0～0.5 mol/L NaCl的Tris-HCl緩沖液進行梯度洗脫（流速1.0 mL/min），共500 mL，見峰收集，每管收集5 mL。酶活性較高的峰以SDS–PAGE凝膠電泳檢測其純度。

4）Phenyl Sepharose 6 FF（HS）疏水柱層析。將陰離子交換層析柱處理后的樣品溶液與含4 mol/L硫酸銨的磷酸鉀緩沖液（50 mmol/L，pH7.0）等體積混合，然后上樣至用含2 mol/L硫酸銨的磷酸鉀緩沖液（50 mmol/L，pH7.0）平衡好的疏水層析柱（規(guī)格：1.6 cm×20 cm）中。用含2～0 mol/L硫酸銨的磷酸鉀緩沖液（50 mmol/L，pH7.0）進行線性梯度洗脫，流速為2.0 mL/min，共450 mL，見峰收集，每管收集3 mL。酶活性較高的峰以SDS–PAGE凝膠電泳檢測其純度。

1.2.4 蛋白質(zhì)含量測定 采用考馬斯亮藍法測定[16]，以牛血清白蛋白為標準。

1.2.5 酶學性質(zhì)的研究

1）最適反應溫度及熱穩(wěn)定性。在pH 6.5的條件下，將酶液在不同溫度（30、35、40、45、50、55、60和65 ℃）下反應10 min，測定其吸光度并計算相對酶活力（以最高的酶活力為100%），以考察酶的最適溫度。將酶液分別置于45、50、55、60 ℃水浴中保溫30 min，然后與底物混合在最適溫度50 ℃下反應10 min，在沸水中滅活5 min，冷卻后測定其吸光度并計算其殘留相對酶活力（以未保溫的酶活力為100%），以考察酶的熱穩(wěn)定性。endprint

2）最適反應pH及pH穩(wěn)定性。分別取pH4.0、4.5、5.0的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（50 mmol/L）和pH5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5的磷酸緩沖液（50 mmol/L）與0.5%魔芋粉溶液按體積比3∶2均勻混合（共0.25 mL），然后加入0.1 mL適當稀釋的酶液在55 ℃反應10 min，沸水中滅活5 min，冷卻后測定不同pH下各個樣品的吸光度，計算出相對酶活力，以pH為橫坐標、 以相對酶活力為縱坐標繪制曲線（酶活力最高者為100%），以找出最適合酶催化的pH區(qū)間。分別用0.15 mL pH4.5、5.0、5.5、6.0、6.5的0.l mol/L磷酸緩沖液與0.1 mL適當稀釋的酶液均勻混合，在55 ℃下保溫30 min，再與底物在55 ℃反應10 min，然后在沸水中滅活5 min，冷卻后測定其吸光度并計算其殘留相對活力（以未保溫的酶活力為100%），以考察酶的pH穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 β-甘露聚糖酶產(chǎn)生菌株的分離與篩選結(jié)果

2.1.1 分離篩選結(jié)果 經(jīng)分離篩選得到1株較好的產(chǎn)β-甘露聚糖酶的菌株（MAN），該菌株來自玉米地表層土壤。剛果紅染色后其H/C值為2.47，如圖1所示。將初篩得到的菌株進行搖瓶發(fā)酵產(chǎn)酶試驗，測其發(fā)酵72 h后發(fā)酵液中β-甘露聚糖酶活力為101 U/mL。

2.2 菌株的鑒定結(jié)果

2.2.1 形態(tài)鑒定 菌落形態(tài)為圓形，顏色為淡黃色，邊緣整齊，且表面粗糙不透明。菌株的菌體呈桿狀，中生橢圓形芽孢，革蘭氏染色陽性。

2.2.2 菌株的16S rDNA鑒定結(jié)果 提取菌株的基因組DNA，通過PCR得到菌株的16S rDNA，如圖2所示。由北京澳科鼎盛公司測得16S rDNA部分的序列長度為1 508 bp，GenBank登陸號為：KF032827。用BLAST比對發(fā)現(xiàn)菌株的16S rDNA序列和芽孢桿菌屬（Bacillus）細菌的相似度較高，用Clustalw軟件對該屬已經(jīng)鑒定的菌株進行多重序列比對后，用MEGA4.0軟件構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖3所示。從圖3可以看出，篩選到的產(chǎn)酶菌株（MAN）與芽孢桿菌的序列同源性較高，尤其與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）有著較高的同源性，與Bacillus subtilis W-6 16S（JX462604.1）菌處于同一發(fā)育地位。

2.3 甘露聚糖酶的初步分離純化

根據(jù)粗酶液的硫酸銨鹽析曲線（未給出），直到硫酸銨濃度達到40%飽和度時目的酶才開始沉淀，于是先向粗酶液中加固體硫酸銨至40%飽和度以除去部分雜蛋白， 4 ℃靜置8 h，10 000 r/min離心10 min，收集上清液，再向收集的上清液中加硫酸銨至飽和度為70%，4 ℃靜置8 h，10 000 r/min離心10 min，沉淀后用作下一步純化。

DEAE-Sepharose FF陰離子交換柱洗脫時有2個明顯的洗脫峰，通過對收集管中的酶活力進行檢測，選擇其中酶活力較高的5管（10～14管）合并（圖4）。Phenyl Sepharose 6 FF（HS）疏水柱層析后的收集管，根據(jù)酶活力測定和SDS-PAGE的結(jié)果，最后選擇其中的5管（12～16管）合并（圖5），濃縮后用于酶學性質(zhì)測定。SDS-PAGE顯示初步純化的酶液中有2條帶，其中濃度較低的一條可能是雜帶，相較于原酶液已經(jīng)具有很高的純度，并且目的酶亞基的分子質(zhì)量大約在29.0～44.0 kDa，和GeneBank中已經(jīng)報道的枯草芽孢桿菌的甘露聚糖酶的大小一致。

2.4 β-甘露聚糖酶酶學性質(zhì)的測定結(jié)果

2.4.1 溫度對β-甘露聚糖酶活性的影響 不同溫度下（30～65 ℃）測定的酶活結(jié)果如圖6所示。由圖6可以看出，在pH6.5的條件下，在30～50 ℃之間，酶的活性隨著溫度的升高而迅速上升，溫度為50 ℃時酶的活性最高，當溫度高于50 ℃時，酶的活性急劇下降，說明酶已經(jīng)較快地失活了。因此，確定酶的最適溫度為50 ℃。

2.4.2 溫度對β-甘露聚糖酶穩(wěn)定性的影響 由圖7可見，在45～55 ℃之間酶的相對穩(wěn)定性較好，殘留活性均在80%以上，且曲線比較平穩(wěn)，溫度超出這一范圍后酶活性迅速下降，說明酶已經(jīng)較快地失活，表明酶宜在50 ℃左右的條件下保存或進行催化反應。

2.4.3 pH對β-甘露聚糖酶活性的影響 從圖8可以看出，在pH4.0～7.5范圍內(nèi)酶活性呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢。在溫度為55 ℃的條件下，在pH4.0～5.0之間，酶活性隨著pH的提高而迅速上升，pH為5.0時，酶的活性最高，但當pH超出這一范圍后，酶的活性急劇下降，說明酶已經(jīng)較快地失活。表明酶于55 ℃時的最適pH為5.0。

2.4.4 pH對β-甘露聚糖酶穩(wěn)定性的影響 由圖9可見，在pH4.5～5.5之間酶的相對穩(wěn)定性較好，其殘留活性均在80%以上，pH超過5.5后酶活性下降較快，酶活性的大小受pH影響較大，pH過大或過小都會使酶蛋白變性，從而導致其酶活性下降甚至失活。因此宜選擇pH4.5～5.5的條件下保存酶或進行酶促反應。

3 結(jié)論

本試驗從玉米地表層土壤中分離出一株β-甘露聚糖酶產(chǎn)生菌（MAN），搖瓶培養(yǎng)后酶活力達到101 U/mL。通過16S rDNA保守序列的鑒定，發(fā)現(xiàn)其與枯草芽孢桿菌同源關(guān)系很近，應該屬其下的一個種類或亞種。利用硫酸銨分級沉淀、陰離子交換層析對酶進行了部分純化。酶學性質(zhì)研究表明，該酶的最適反應溫度為50 ℃，最適反應pH為5.0；在45～55 ℃之間酶的穩(wěn)定性較好，保溫30 min后其殘留活性均在80%以上；在pH4.5～5.5之間酶的穩(wěn)定性較好，保持30 min后其殘留活性均在80%以上。

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