兔病毒性出血癥DNA疫苗研究進(jìn)展

付強(qiáng)　郭廣君　程立坤　王艷

摘要：兔病毒性出血癥是養(yǎng)兔業(yè)最重要的疾病之一，其發(fā)病急，致死率高，可對養(yǎng)兔業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，在疫苗研究方面，由于傳統(tǒng)組織滅活疫苗存在諸多缺點(diǎn)，迫切需要研制新型疫苗。本文主要從兔病毒性出血癥DNA疫苗的構(gòu)建、免疫佐劑、臨床免疫途徑以及臨床使用的效果等方面進(jìn)行簡要介紹。

關(guān)鍵詞：兔瘟；DNA疫苗；甲病毒復(fù)制子載體疫苗；免疫

中圖分類號：S858.291 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B 文章編號：1007-273X（2014）08-0082-03

兔病毒性出血癥（rabbit hemorrhagic disease，RHD），俗稱兔瘟，是由兔出血癥病毒（RHDV）引起的一種高度接觸性、致死性傳染病，該病毒屬杯狀病毒科、兔病毒屬。1984年中國第一次報道了該病，一年后韓國也有了報道，隨后在1987～1989年間，該病迅速在歐洲蔓延，給養(yǎng)兔生產(chǎn)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。感染兔通常48～72 h死亡，表現(xiàn)出以肝變性壞死和肺出血為典型特征的組織病變，1989年OIE將該病正式列為“國際動物保健編目” B類傳染病，我國將該病劃分至二類動物傳染病[1]。衣殼蛋白VP60為RHDV惟一的結(jié)構(gòu)蛋白，在誘導(dǎo)宿主免疫反應(yīng)中起重要作用，是病毒免疫保護(hù)性抗原，在新型診斷制劑、疫苗的研制中具有十分重要的應(yīng)用價值。在疫苗研制方面除了組織滅活苗外，還出現(xiàn)多種新型疫苗，其中DNA疫苗因其安全、穩(wěn)定、高效而得到廣泛研究。目前，DNA疫苗已在病毒性疾病、細(xì)菌性疾病、寄生蟲免疫、抗腫瘤免疫、預(yù)防變態(tài)反應(yīng)中發(fā)揮了巨大的作用，目前在國外已有4種獸用DNA疫苗獲得批準(zhǔn)上市，分別為傳染性造血器官壞死病毒DNA疫苗、西尼羅河病毒DNA疫苗、犬黑色素瘤DNA疫苗和生長激素釋放激素DNA產(chǎn)品[2]，標(biāo)志著DNA疫苗開始真正步入了產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用階段。本文主要從DNA疫苗在兔病毒性出血癥的應(yīng)用研究方面作簡要介紹。

1 兔瘟疫苗研發(fā)動態(tài)

在兔瘟的防治中，目前廣泛應(yīng)用的兔病毒性出血癥滅活疫苗，系用兔病毒性出血癥病毒接種易感家兔，收獲含毒組織制成乳劑，經(jīng)甲醛溶液滅活后制成[3]。在制備過程中，如果兔舍衛(wèi)生狀況、肝脾摘取、病毒滅活等環(huán)節(jié)控制不嚴(yán)，會造成散毒、染菌，疫苗物理性狀為組織顆粒懸浮液，免疫時易堵塞針頭，此外，生產(chǎn)每批次疫苗需要攻毒上百只兔子，成本高，也不符合動物福利要求。細(xì)胞滅活苗制備工藝簡單，培養(yǎng)方便快捷，成本較低，污染及散毒都易控制，科研人員曾以RHDV 感染 IBRS-2 細(xì)胞、兔睪丸細(xì)胞、兔腎細(xì)胞和Vero細(xì)胞，均已失敗告終，至今還沒有一種能夠使其長期穩(wěn)定傳代的細(xì)胞系[4]。但RHDV的血清型比較單一，衣殼蛋白VP60在誘導(dǎo)宿主免疫反應(yīng)中的重要作用及其相對比較保守的氨基酸序列為基因工程苗的研制提供了方便。據(jù)報道，在某些系統(tǒng)中，表達(dá)的重組蛋白可自發(fā)聚合成病毒樣顆粒（VLPs）的衣殼蛋白，并且該產(chǎn)物在物理形態(tài)和免疫原性上與完整的自然野毒株相似，但該VLPs不含病毒RNA，不存在散毒的危險，并且可以通過口服途徑進(jìn)行免疫[5]。近年來，RHDV新型疫苗的研究正是以病毒衣殼蛋白VP60為基礎(chǔ)，目前國內(nèi)外學(xué)者已在大腸桿菌[6]、酵母[7]、昆蟲細(xì)胞[8]、腺病毒[9]、羊口瘡病毒[10]以及植物[11]等多種表達(dá)系統(tǒng)中成功表達(dá)了VP60蛋白，所有表達(dá)產(chǎn)物都可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫保護(hù)抵抗RHDV的致死量攻擊。但從目前RHDV基因工程疫苗的研究來看，仍然存在一些問題，比如：不可溶性及免疫效果相對較差的缺點(diǎn)，生物的安全以及生產(chǎn)成本的問題[12]，目前均未能實(shí)現(xiàn)疫苗產(chǎn)業(yè)化。

2 DNA疫苗概述

DNA 疫苗又稱為核酸疫苗、基因疫苗，是指將含有編碼某種抗原蛋白基因序列的質(zhì)粒載體作為疫苗，采用某種方法直接導(dǎo)入動物細(xì)胞內(nèi)，然后通過宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)合成抗原蛋白，誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生對該抗原蛋白的免疫應(yīng)答，從而使被接種動物獲得相應(yīng)的免疫保護(hù)，以達(dá)到預(yù)防和（或）治療疾病的目的[13]。與其他類型的基因工程疫苗相比，核酸疫苗具有自身的優(yōu)點(diǎn)：核酸疫苗只采用病毒的部分核酸序列，不存在散毒或返強(qiáng)的危險；不存在病毒活苗的安全性問題；在動物體內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，不存在一般原核表達(dá)系統(tǒng)中蛋白翻譯后的糖基化問題[12]。鑒于RHDV核酸疫苗研究的必要性以及核酸疫苗本身具有的諸多優(yōu)點(diǎn)，開發(fā)RHDV核酸疫苗存在很大的發(fā)展前景。但目前常規(guī)DNA疫苗還存在幾點(diǎn)不足：比如DNA疫苗導(dǎo)入細(xì)胞和機(jī)體的效率差，表達(dá)水平低；存在遺傳毒性、致瘤反應(yīng)等理論上的安全隱患，基因疫苗的免疫尚未達(dá)到預(yù)期的理想效果。這些局限促使研究者們?nèi)ふ乙环N高表達(dá)、安全性好、能引起較強(qiáng)免疫效果的DNA疫苗載體來克服常規(guī)DNA疫苗的不足。

“自殺性”DNA疫苗（suicidal DNA vaccine）就是基于常規(guī)DNA疫苗和“自主復(fù)制型”RNA疫苗（self-replicating RNA vaccine）基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新型疫苗，不僅具有常規(guī)DNA疫苗易制備、運(yùn)輸、保存等方面的優(yōu)點(diǎn)，而且還有“自主復(fù)制型”RNA疫苗的安全性與有效性[14]。該疫苗是以甲病毒（Alphaviruses） 尤其是Semliki森林病毒（Semliki Forest virus，SFV） 和Sindbis病毒（SINV） 衍生的DNA/RNA載體，被廣泛用于外源基因的表達(dá)，在安全性上，自殺性DNA疫苗在動物體內(nèi)一過性表達(dá)外源基因后，隨細(xì)胞凋亡而被機(jī)體清除，避免了DNA質(zhì)?？赡苷系剿拗骷?xì)胞染色體或可能造成免疫耐受等隱患，自殺性DNA疫苗可通過激活天然的抗病毒途徑而打破免疫耐受。在免疫效率方面，自殺性DNA疫苗誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)比傳統(tǒng)DNA疫苗高，用低于傳統(tǒng)DNA疫苗1/100～1/1 000的劑量免疫，可獲得與傳統(tǒng)DNA疫苗相當(dāng)?shù)拿庖邞?yīng)答[15]。因此相對于傳統(tǒng)DNA疫苗，自殺性DNA疫苗更具備安全、高效的優(yōu)點(diǎn)。在實(shí)際應(yīng)用中，DNA疫苗的免疫效果跟載體、佐劑、疫苗遞送途徑等因素密切相關(guān)。

3 DNA疫苗的載體

DNA疫苗載體質(zhì)粒作為編碼抗原目的基因表達(dá)抗原的工具，其組成與結(jié)構(gòu)特征對DNA疫苗免疫原性有顯著影響。用作DNA疫苗的載體必須具備以下特點(diǎn)：在機(jī)體細(xì)胞內(nèi)能高水平地表達(dá)目的基因；本身不復(fù)制；不會整合到宿主染色體中。哺乳動物表達(dá)載體能使重組質(zhì)粒獲得高水平表達(dá)的重組蛋白。

原冬偉等[16]克隆RHDV WHNRH株的VP60基因，并將其重組到真核表達(dá)載體pcDNA3.1（+）中，成功構(gòu)建了分泌型和細(xì)胞內(nèi)型的重組質(zhì)粒pcDNA-VP60，可以誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性體液免疫和細(xì)胞免疫，至于VP60 DNA疫苗的實(shí)際效果，還需要進(jìn)一步研究其在兔體內(nèi)表達(dá)及其免疫應(yīng)答情況。程英杰等[17]通過RT-PCR的方法擴(kuò)增RHDV衣殼蛋白VP60，將其重組到甲病毒復(fù)制子載體pSCA1上，構(gòu)建了包含RHDV衣殼蛋白VP60的重組復(fù)制子載體pSCA1/VP60，借助脂質(zhì)體將純化的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，該重組質(zhì)粒在BHK-21細(xì)胞中可以表達(dá)具有反應(yīng)原性的RHDV衣殼蛋白，ELISA檢測表明該重組質(zhì)粒在試驗(yàn)兔體內(nèi)可誘導(dǎo)產(chǎn)生RHDV特異性抗體，淋巴細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子檢測表明該重組質(zhì)粒在試驗(yàn)兔體內(nèi)可以誘導(dǎo)細(xì)胞免疫，與對照組相比，差異性顯著。

4 佐劑在兔瘟DNA疫苗中的應(yīng)用

應(yīng)用佐劑也是提高DNA疫苗免疫原性有效策略之一。隨著對DNA疫苗研究的深入，人們逐漸認(rèn)識到直接注射裸DNA進(jìn)行免疫所誘導(dǎo)產(chǎn)生的免疫應(yīng)答和免疫記憶都不夠理想，為了提高DNA疫苗的免疫效果，研究者們選用了不少免疫佐劑來提高DNA疫苗的免疫原性。細(xì)胞因子是基因佐劑的一種，為一類可溶性的小分子多肽或蛋白質(zhì)，通過與細(xì)胞膜表面受體相互作用發(fā)揮其生理活性。細(xì)胞因子在體內(nèi)能激活和調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞，通過不同的作用環(huán)節(jié)調(diào)節(jié)或增強(qiáng)DNA疫苗的免疫效應(yīng)而發(fā)揮佐劑作用。多種細(xì)胞因子如IL-2、IL-4、IL-12、IL-15、IL-18、GM-CSF及INF-γ等已成功地成為病毒DNA疫苗的免疫佐劑，通過增強(qiáng)機(jī)體的細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答，從而增強(qiáng)了DNA疫苗的特異性免疫反應(yīng)[18]。張夏蘭[19]為研究分子佐劑pcDNA-IL-6對家兔免疫應(yīng)答的影響，構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-IL-6，并將其與pcDNA-VP60、兔瘟組織滅活苗分別共同免疫家兔，用血凝抑制試驗(yàn)檢測家兔RHDV特異性抗體水平。結(jié)果表明，在免疫后的7～70 d，無論是核酸疫苗pcDNA-VP60或是兔瘟組織滅活苗，與真核重組質(zhì)粒pcDNA-IL-6共注射免疫組抗體水平均高于未注射pcDNA-IL-6質(zhì)粒免疫組。結(jié)果表明，真核重組質(zhì)粒pcDNA-IL-6對重組質(zhì)粒pcDNA-VP60和組織滅活苗的免疫均具有免疫增強(qiáng)作用。

5 疫苗效力檢測

疫苗效力檢測是評價疫苗是否合格的主要標(biāo)準(zhǔn)，合理有效的免疫途徑與接種方式對提高DNA疫苗的免疫效率十分關(guān)鍵，DNA疫苗的免疫途徑主要是肌肉注射和皮下注射，其中肌肉注射使用較多，但皮下注射可將抗原更好地傳遞給提呈細(xì)胞，特別是樹突狀細(xì)胞。此外采用菌影[20]、減毒胞內(nèi)菌[21， 22]通過黏膜自然感染途徑運(yùn)送DNA疫苗成為近年來研究的熱點(diǎn)。

Qiu等[23]使用減毒沙門氏菌作為載體通過口服方式遞送DNA疫苗來預(yù)防RHDV，結(jié)果顯示減毒沙門氏菌能夠有效轉(zhuǎn)導(dǎo)兔腹腔巨噬細(xì)胞，重組菌株SL/pcDNA3-VP60能夠有效的在兔體內(nèi)誘導(dǎo)VP60特異性免疫反應(yīng)，并且可以為攻毒提供約67%的免疫保護(hù)，雖然未能全保護(hù)，但口服方式最為簡便，值得繼續(xù)優(yōu)化提高。Yuan等[24]制備DNA疫苗pcDNA-VP60，為評價疫苗的效果，用pcDNA3.1 （+）疫苗與商用滅活疫苗分別免疫兔子，免疫后攻毒試驗(yàn)表明，用DNA疫苗免疫的兔子和商用滅活疫苗具有同等保護(hù)效果，均經(jīng)受住強(qiáng)毒的攻擊。Cheng 等[25]構(gòu)建了一種基于兔病毒性出血癥衣殼蛋白優(yōu)勢抗原區(qū)域的一種“自殺性”DNA疫苗pSCA/VP60，為評價重組質(zhì)粒作為DNA疫苗對動物的免疫效果，通過肌肉注射免疫試驗(yàn)兔，并以空載體pSCA1、PBS為試驗(yàn)對照組，以ELISA檢測血清RHDV特異性抗體變化，以MTT法檢測其外周血淋巴細(xì)胞（PBL）的增殖反應(yīng)活性，以干擾素-γ（IFN-γ）和白介素-4（IL-4）ELISA試劑盒檢測體內(nèi)細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4水平，以攻毒保護(hù)試驗(yàn)評價其誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)抵抗強(qiáng)毒攻擊的能力。攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果表明該DNA疫苗可以抵抗RHDV強(qiáng)毒攻擊。

6 小結(jié)

DNA疫苗作為第三代疫苗，具有廣闊的發(fā)展前景，在畜禽傳染病方面與豬瘟、豬口蹄疫、禽流感、雞新城疫、雞馬立克氏病、傳染性支氣管炎等相關(guān)的DNA疫苗正在研究探索中。雖然還存在一些缺點(diǎn)，如轉(zhuǎn)染效率比較低，這可能是影響其誘導(dǎo)足夠的免疫保護(hù)力和向臨床應(yīng)用發(fā)展的主要因素之一。因此，對質(zhì)粒載體的進(jìn)一步改造和提高轉(zhuǎn)染效率的研究，以及在佐劑等方面的研究仍是今后研究的重點(diǎn)。相信在廣大科研工作者的共同努力下，一種安全、經(jīng)濟(jì)、高效的新型DNA疫苗將早日獲得產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。

參考文獻(xiàn)：

[1] 高景鵬. 兔出血癥病毒亞基因組在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)及其免疫原性研究[D]. 呼和浩特：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

[2] GONALVES G A PRATHER， K L MONTEIRO G A et al. Engineering of Escherichia coli strains for plasmid biopharmaceutical production： Scale-up challenges[J]. Vaccine， 2014：

[3] 中國獸用生物制品規(guī)程（兔病毒性出血癥滅活疫苗制造及檢驗(yàn)規(guī)程），2000版

[4] ABRANTES J W Rabbit haemorrhagic disease （RHD） and rabbit haemorrhagic disease virus （RHDV）： a review[J]. Veterinary research， 2012， 43（1）：2879-2981.

[5] CRISCI E， BARCENA J， MONTOYA M Virus-like particles： The new frontier of vaccines for animal viral infections[J]. Veterinary Immunology and Immunopathology， 2012， 148（3-4）： 211-215.

[6] 張大鵬， 呂 寧， 符容婕， 等. 兔出血癥病毒衣殼蛋白VP60的原核表達(dá)及多克隆抗體制備[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版）， 2012， 40（3）： 18-28.

[7] ERLINDA F， R. Conformational and thermal stability improvements for the large-scale production of yeast-derived rabbit hemorrhagic disease virus-like particles as multipurpose vaccine[J]. PloS One， 2013， 8（2）：56417.

[8] CHEN， M， SONG Y FAN Z， et al. Immunogenicity of different recombinant rabbit hemorrhagic disease virus-like particles carrying CD8+ T cell epitope from chicken ovalbumin （OVA）[J]. Virus Research， 2014， 183.

[9] FERNANDEZ E， TOLEDO J R， ChIONG M， et al. Single dose adenovirus vectored vaccine induces a potent and long-lasting immune response against rabbit hemorrhagic disease virus after parenteral or mucosal administration[J]. Vet Immunol Immunopathol， 2011， 142（3-4）： 179-188.

[10] ROHDE J， SCHIRMEIER H， GRANZOW， H， et al. A new recombinant Orf virus （ORFV， Parapoxvirus） protects rabbits against lethal infection with rabbit hemorrhagic disease virus （RHDV）[J]. Vaccine， 2011， 29（49）： 9256-9264.

[11] MIKSCHOFSKY H， SCHIRRMEIER， H， KATZEL A， et al. Expression of truncated CTB：：VP60 in tobacco exhibited no immunogenicity in rabbits[J]. Plant Sci， 2011， 180（2）： 246-250.

[12] 張夏蘭， 王紅寧， 張昌菊， 等. 兔病毒性出血癥基因工程疫苗的研究進(jìn)展[J]. 中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報， 2007， 29（10）： 821-824.

[13] 郭 楊， 方 剛. DNA疫苗研究進(jìn)展[J]. 微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展， 2013， 41（5）： 64-68.

[14] LEITNER W W， YING H， DRIVER， D A， et al. Enhancement of tumor-specific immune response with plasmid DNA replicon vectors[J]. Cancer Res， 2000， 60（1）： 51-55.

[15] 熊海林. 斑點(diǎn)叉尾鮰病毒（CCV）ORF6基因“自殺性”DNA疫苗的構(gòu)建與免疫效果研究[D].武漢： 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2011.

[16] 原冬偉， 劉家森， 郭東春， 等. 兔出血癥病毒TP株VP60基因DNA免疫小鼠的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報， 2011， （8）： 653-657.

[17] 程英杰. 兔病毒性出血癥基因工程疫苗研究[D]. 蘭州： 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2013.

[18] KIM J J， YANG J S， MANSON K H， et al. Modulation of antigen-specific cellular immune responses to DNA vaccination in rhesus macaques through the use of IL-2， IFN-gamma， or IL-4 gene adjuvants[J]. Vaccine， 2001， 19（17-19）： 2496-2505.

[19] 張夏蘭， 楊 鑫， 周英順， 等. 兔IL-6真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及其分子佐劑效應(yīng)的初步研究[J]. 草食家畜， 2012， （3）： 72-75.

[20] MUHAMMAD A， CHAMPEIMONL J， Mayr U B， et al. Bacterial ghosts as carriers of protein subunit and DNA-encoded antigens for vaccine applications[J]. Expert Review of Vaccines， 2012， 11（1）： 97-116.

[21] KONG W BROVOLD M， KOENEMAN B A， et al. Turning self-destructing Salmonella into a universal DNA vaccine delivery platform[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences， 2012， 109（47）： 19414-19419.

[22] JUAREZ-RODRIGUEZ M D， YANG J， KADER R， et al. Live Attenuated Salmonella Vaccines Displaying Regulated Delayed Lysis and Delayed Antigen Synthesis To Confer Protection against Mycobacterium tuberculosis[J]. Infection and Immunity， 2012， 80（2）： 818-831.

[23] QIU L， WANG X， HAO H， et al. Oral administration of attenuated Salmonella typhimurium containing a DNA vaccine against rabbit haemorrhagic disease[J]. J Virol Methods， 2013， 188（1-2）： 108-113.

[24] YUAN D， QU L， LIU J， et al. DNA vaccination with a gene encoding VP60 elicited protective immunity against rabbit hemorrhagic disease virus[J]. Veterinary microbiology， 2013， 164（1）： 1-8.

[25] CHENG Y， CHEN， Z， Li C， et al. Protective immune responses in rabbits induced by a suicidal DNA vaccine of the VP60 gene of rabbit hemorrhagic disease virus[J]. Antiviral Res， 2013， 97（3）： 227-231.