巴克夏豬氟烷基因PCR—RFLP分析

郭咪咪　梅書棋　喬木　吳俊靜　李助南

摘要：為選育抗應(yīng)激巴克夏豬群新品系，采用PCR-RFLP技術(shù)檢測了156頭巴克夏豬氟烷基因的基因型分布情況。結(jié)果表明，在試驗豬群中氟烷顯性基因HalN頻率和隱性基因Haln頻率分別為1.00和0，該豬群已實現(xiàn)氟烷隱性基因的剔除。豬氟烷基因PCR-RFLP分析技術(shù)為優(yōu)質(zhì)豬的培育提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：巴克夏豬；氟烷基因；PCR-RFLP

中圖分類號：S813.3 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1007-273X（2014）08-0005-03

豬的應(yīng)激綜合征（ porcine stress syndrome，PSS） 指豬在外界應(yīng)激條件刺激下產(chǎn)生的肌肉強(qiáng)直收縮，并伴隨體溫急劇升高，心跳加快，皮膚發(fā)紺等一系列惡性高溫綜合癥狀，一些個體在應(yīng)激過程中往往突然死亡或宰后出現(xiàn) PSE肉[1]。PSS是由于氟烷基因（Halothane，HAL）或稱骨骼肌蘭尼定受體基因（Ryanodine ReceptorGene，RYR1）突變所致，蘭尼定受體基因CDS序列的 C1843-T1843突變致使受體蛋白的第615位的氨基酸發(fā)生變異（Arg-Cys），引起蛋白結(jié)構(gòu)和功能的改變；這種改變使豬在應(yīng)激狀態(tài)下肌肉組織中大量的 Ca2+異常釋放，引起血漿β-內(nèi)啡呔過量分泌，電解質(zhì)代謝出現(xiàn)紊亂，發(fā)生肌肉持續(xù)收縮，進(jìn)而使豬產(chǎn)生惡性高熱；肌肉組織收縮需要大量能量，氧化分解供能不足，需要依靠糖酵解來獲得能量，致使乳酸產(chǎn)生過多，肌肉pH異常降低，出現(xiàn)PSE肉[2]。

豬氟烷基因的檢測方法先后有氟烷測定法、血液遺傳標(biāo)記選擇法、CK 血清水平測定法和 DNA 診斷法[ 3，4]。目前普遍應(yīng)用的是聚合酶鏈反應(yīng)結(jié)合限制性內(nèi)切酶技術(shù)（polymerase chain reaction-restriction endonuclease fragment length polymophism，PCR-RFLP） ，該技術(shù)快速、準(zhǔn)確、便捷、樣品來源廣泛（ 豬毛、血液、肌肉、耳組織等均可），且所需的樣品量極少，只需少量的全血、肌肉組織甚至幾根豬毛即可準(zhǔn)確的檢測出豬的氟烷基因型[5-8]。

氟烷基因隱性純合子的存在降低了豬肉品質(zhì)，對豬肉加工及銷售造成了嚴(yán)重影響，制約了現(xiàn)代養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展。本試驗從巴克夏豬群中提取DNA，采用PCR-RFLP方法對巴克夏豬群進(jìn)行氟烷基因檢測，以指導(dǎo)種豬的選育。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

所檢測的156頭巴克夏豬來自湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所良種育種豬場。用耳號鉗取火柴頭大小的耳組織，每個個體采集耳組織樣1 g左右，-20 ℃冷凍保存 。

1.2 試劑與儀器

主要試劑：組織細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒購自艾德萊生物公司；引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成，HhaⅠ限制性內(nèi)切酶購自湖北晶茂生物技術(shù)有限公司

主要儀器：DNA Engine PCR儀、DYY-6B電泳儀（北京市六一儀器廠），超微量分光光度計Photometer（北京天翔飛域儀器設(shè)備有限公司），LRH-250F生化培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司），美國Bio-rad伯樂凝膠成像系統(tǒng)（聯(lián)想生物科技有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 DNA的提取 采用組織基因組DNA提取試劑盒（購自艾德萊生物公司），按照試劑盒步驟提取基因組DNA，將提取后的DNA置于-20 ℃保存。

1.3.2 引物設(shè)計 引物合成參考文獻(xiàn)報道的序列設(shè)計[3]。上游引物： 5-TCCAGTTTGCCACAGGTCCTACCA- 3；下游引物： 5-ATTCACCGGAGTGGAGTCTCTGAG-3。

1.3.3 PCR反應(yīng) PCR反應(yīng)體系如下：lμL PrimerⅠ（10 Umol/L），1μL PrimerⅡ（10 Umol/L），10μL 2×Taq Master Mix，DNA模板2μL，加去離子水至總體積20 μL。

PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性4 min；然后4 ℃變性40 s，67 ℃復(fù)性40 s，72 ℃延伸50 s，共35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物置于4 ℃保存，各取5μLPCR產(chǎn)物與分子質(zhì)量2 000 bp Marker同時進(jìn)行1%瓊脂糖電泳（130V）25 min檢測，在凝膠成像系統(tǒng)中掃描成像。

1.3.4 擴(kuò)增產(chǎn)物的HhaⅠ-RFLP分析 按HhaⅠ內(nèi)切酶說明書要求，取6μLPCR產(chǎn)物，1μL10×Buffer Tango，0.5μL HhaⅠ內(nèi)切酶（ 10 U/ULl），加ddH2O 至總體積10μL。在37 ℃溫育酶切過夜，用1%瓊脂糖凝膠電泳（130V）25 min分別對酶切產(chǎn)物進(jìn)行檢測，成像系統(tǒng)觀察并記錄酶切結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取

采用組織基因組DNA提取試劑盒，提取156頭巴克夏豬耳組織的基因組DNA，瓊脂糖電泳結(jié)果（圖1）表明，DNA的純度高，無RNA、蛋白質(zhì)和多糖雜質(zhì)，經(jīng)超微量分光光度計檢測OD值和DNA濃度均符合后續(xù)試驗的需求。

圖1 豬基因組DNA提取結(jié)果

2.2 氟烷基因PCR擴(kuò)增

從豬耳組織樣品中提取基因組DNA，采用設(shè)計的引物PCR擴(kuò)增后，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測均顯示單一明亮條帶，其長度為659 bp的DNA片段 （圖2）。

圖2 豬Hal基因PCR擴(kuò)增電泳圖譜

2.3 氟烷基因酶切HhaⅠ-RFLP結(jié)果

HhaI限制性內(nèi)切酶可識別野生型HalN基因的5-GCG↓C-3即C位點，經(jīng)PCR產(chǎn)物長度為659 bp，當(dāng)氟烷基因未發(fā)生突變時，經(jīng)HhaⅠ酶切后產(chǎn)生兩個片段，長度分別為493 bp和166 bp，基因型為HalNN；當(dāng)?shù)?843位堿基發(fā)生C→T突變時，不能被HhaⅠ識別，酶切后只有一個片段，長度為659 bp，基因型為Halnn；當(dāng)一個氟烷等位基因發(fā)生突變，而另一個正常，經(jīng)HhaⅠ酶切后產(chǎn)生3個片段，分別是659 bp，493 bp和166 bp，基因型為HalNn。

本次檢測各樣品所獲659 bp的PCR產(chǎn)物，經(jīng)HhaⅠ限制性內(nèi)切酶酶切，均出現(xiàn)大小在493 bp和166 bp被完全切割的兩條條帶，無659 bp條帶殘留（圖3）。

圖3 豬Hal基因HhaⅠ-RFLP多態(tài)分型結(jié)果

2.4 豬Hal基因基因型和基因頻率

由表1可見，所檢測種豬群中NN基因型為1.00，Nn和nn基因型均為0，N基因頻率為1.00，n基因頻率為0。被檢豬群氟烷基因型均為顯性純合子HalNN，未發(fā)現(xiàn)氟烷基因隱性純合子Halnn和氟烷雜合子HalNn，不含有氟烷敏感基因Haln。

3 小結(jié)與討論

影響豬肉品質(zhì)的因素主要包括遺傳因素、營養(yǎng)因素和環(huán)境因素，其中遺傳因素是影響豬肉性狀的重要因素之一。DNA標(biāo)記輔助選擇（簡稱MAS）為豬的育種提供了一個新的突破性方法，豬育種中的若干重要DNA標(biāo)記的理論研究和實踐應(yīng)用促進(jìn)了豬的育種發(fā)展。PCR-RFLP是目前普遍應(yīng)用的檢測豬氟烷基因方法，采用PCR擴(kuò)增的目的片段，經(jīng)限制性內(nèi)切酶溫育消化后，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，根據(jù)酶切片段長度多態(tài)性識別應(yīng)激敏感豬和抗應(yīng)激豬。

研究表明[9，10]，豬氟烷敏感基因（Haln）具有多效性，一方面導(dǎo)致肌肉肥大，提高胴體瘦肉率；另一方面易誘導(dǎo)發(fā)生 MHS（malignant hyperthermiasy ndrome，惡性高熱綜合征），產(chǎn)生PSE肉，降低肌肉品質(zhì)，豬的肉質(zhì)性狀、生長發(fā)育性狀和繁殖性狀都逐漸變劣，而氟烷基因雜合子豬在生產(chǎn)性能和體型外貌上具有雜合優(yōu)勢，更易被選作種用。Pommier 等[11]認(rèn)為 NN、Nn和 nn基因型表現(xiàn)為PSE肉的幾率分別是 53.8%，79.8% 和 90.9%。蔣思文等[12]報道豬氟烷基因Halnn比HalNN、HalNn雜合子每窩產(chǎn)仔數(shù)和活仔數(shù)少2.0～2.7頭，繁殖性能NN﹥Nn﹥nn；鞠慧萍等[13]研究表明，氟烷敏感基因可導(dǎo)致總產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)和斷奶仔豬數(shù)下降，初生窩重和個體斷奶重降低，并使生長速度減慢，即Haln對繁殖性能有較顯著的不良影響。綜合考慮巴克夏豬在我國商品豬繁育體系中的作用，對Haln基因的利弊進(jìn)行權(quán)衡，認(rèn)為利用成熟的氟烷基因分子標(biāo)記輔助選擇對巴克夏豬群的Haln基因進(jìn)行剔除，結(jié)合適當(dāng)?shù)倪x育措施，建立抗應(yīng)激豬群，提高種豬質(zhì)量。伍少欽等[2]對加系長白、加系大白和丹系長白和丹系長白的公豬和母豬的氟烷基因進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示均未發(fā)現(xiàn)隱性純合氟烷基因型（Halnn）和雜合氟烷基因型（HalNn）。宋忠旭等[14]在2005年采用PCR-RFLP方法對湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所種豬場的大白豬進(jìn)行了氟烷基因的檢測，結(jié)果顯示，檢測的151頭大白豬中基因型均為NN，未檢出Nn和nn基因型。本次試驗檢測的156頭巴克夏豬群中基因型均為NN，說明在該良種豬育種場已基本實現(xiàn)氟烷敏感基因Haln的淘汰，組建了高繁殖力、抗應(yīng)激豬群，為新品系的選育奠定了基礎(chǔ)。

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