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    巴克夏豬氟烷基因PCR—RFLP分析

    2014-10-27 00:01:28郭咪咪梅書棋喬木吳俊靜李助南
    湖北畜牧獸醫(yī) 2014年8期

    郭咪咪 梅書棋 喬木 吳俊靜 李助南

    摘要:為選育抗應(yīng)激巴克夏豬群新品系,采用PCR-RFLP技術(shù)檢測了156頭巴克夏豬氟烷基因的基因型分布情況。結(jié)果表明,在試驗(yàn)豬群中氟烷顯性基因HalN頻率和隱性基因Haln頻率分別為1.00和0,該豬群已實(shí)現(xiàn)氟烷隱性基因的剔除。豬氟烷基因PCR-RFLP分析技術(shù)為優(yōu)質(zhì)豬的培育提供了理論依據(jù)。

    關(guān)鍵詞:巴克夏豬;氟烷基因;PCR-RFLP

    中圖分類號(hào):S813.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):1007-273X(2014)08-0005-03

    豬的應(yīng)激綜合征( porcine stress syndrome,PSS) 指豬在外界應(yīng)激條件刺激下產(chǎn)生的肌肉強(qiáng)直收縮,并伴隨體溫急劇升高,心跳加快,皮膚發(fā)紺等一系列惡性高溫綜合癥狀,一些個(gè)體在應(yīng)激過程中往往突然死亡或宰后出現(xiàn) PSE肉[1]。PSS是由于氟烷基因(Halothane,HAL)或稱骨骼肌蘭尼定受體基因(Ryanodine ReceptorGene,RYR1)突變所致,蘭尼定受體基因CDS序列的 C1843-T1843突變致使受體蛋白的第615位的氨基酸發(fā)生變異(Arg-Cys),引起蛋白結(jié)構(gòu)和功能的改變;這種改變使豬在應(yīng)激狀態(tài)下肌肉組織中大量的 Ca2+異常釋放,引起血漿β-內(nèi)啡呔過量分泌,電解質(zhì)代謝出現(xiàn)紊亂,發(fā)生肌肉持續(xù)收縮,進(jìn)而使豬產(chǎn)生惡性高熱;肌肉組織收縮需要大量能量,氧化分解供能不足,需要依靠糖酵解來獲得能量,致使乳酸產(chǎn)生過多,肌肉pH異常降低,出現(xiàn)PSE肉[2]。

    豬氟烷基因的檢測方法先后有氟烷測定法、血液遺傳標(biāo)記選擇法、CK 血清水平測定法和 DNA 診斷法[ 3,4]。目前普遍應(yīng)用的是聚合酶鏈反應(yīng)結(jié)合限制性內(nèi)切酶技術(shù)(polymerase chain reaction-restriction endonuclease fragment length polymophism,PCR-RFLP) ,該技術(shù)快速、準(zhǔn)確、便捷、樣品來源廣泛( 豬毛、血液、肌肉、耳組織等均可),且所需的樣品量極少,只需少量的全血、肌肉組織甚至幾根豬毛即可準(zhǔn)確的檢測出豬的氟烷基因型[5-8]。

    氟烷基因隱性純合子的存在降低了豬肉品質(zhì),對(duì)豬肉加工及銷售造成了嚴(yán)重影響,制約了現(xiàn)代養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展。本試驗(yàn)從巴克夏豬群中提取DNA,采用PCR-RFLP方法對(duì)巴克夏豬群進(jìn)行氟烷基因檢測,以指導(dǎo)種豬的選育。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

    所檢測的156頭巴克夏豬來自湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所良種育種豬場。用耳號(hào)鉗取火柴頭大小的耳組織,每個(gè)個(gè)體采集耳組織樣1 g左右,-20 ℃冷凍保存 。

    1.2 試劑與儀器

    主要試劑:組織細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒購自艾德萊生物公司;引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成,HhaⅠ限制性內(nèi)切酶購自湖北晶茂生物技術(shù)有限公司

    主要儀器:DNA Engine PCR儀、DYY-6B電泳儀(北京市六一儀器廠),超微量分光光度計(jì)Photometer(北京天翔飛域儀器設(shè)備有限公司),LRH-250F生化培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司),美國Bio-rad伯樂凝膠成像系統(tǒng)(聯(lián)想生物科技有限公司)。

    1.3 試驗(yàn)方法

    1.3.1 DNA的提取 采用組織基因組DNA提取試劑盒(購自艾德萊生物公司),按照試劑盒步驟提取基因組DNA,將提取后的DNA置于-20 ℃保存。

    1.3.2 引物設(shè)計(jì) 引物合成參考文獻(xiàn)報(bào)道的序列設(shè)計(jì)[3]。上游引物: 5-TCCAGTTTGCCACAGGTCCTACCA- 3;下游引物: 5-ATTCACCGGAGTGGAGTCTCTGAG-3。

    1.3.3 PCR反應(yīng) PCR反應(yīng)體系如下:lμL PrimerⅠ(10 Umol/L),1μL PrimerⅡ(10 Umol/L),10μL 2×Taq Master Mix,DNA模板2μL,加去離子水至總體積20 μL。

    PCR反應(yīng)程序:94 ℃預(yù)變性4 min;然后4 ℃變性40 s,67 ℃復(fù)性40 s,72 ℃延伸50 s,共35個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物置于4 ℃保存,各取5μLPCR產(chǎn)物與分子質(zhì)量2 000 bp Marker同時(shí)進(jìn)行1%瓊脂糖電泳(130V)25 min檢測,在凝膠成像系統(tǒng)中掃描成像。

    1.3.4 擴(kuò)增產(chǎn)物的HhaⅠ-RFLP分析 按HhaⅠ內(nèi)切酶說明書要求,取6μLPCR產(chǎn)物,1μL10×Buffer Tango,0.5μL HhaⅠ內(nèi)切酶( 10 U/ULl),加ddH2O 至總體積10μL。在37 ℃溫育酶切過夜,用1%瓊脂糖凝膠電泳(130V)25 min分別對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行檢測,成像系統(tǒng)觀察并記錄酶切結(jié)果。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 DNA提取

    采用組織基因組DNA提取試劑盒,提取156頭巴克夏豬耳組織的基因組DNA,瓊脂糖電泳結(jié)果(圖1)表明,DNA的純度高,無RNA、蛋白質(zhì)和多糖雜質(zhì),經(jīng)超微量分光光度計(jì)檢測OD值和DNA濃度均符合后續(xù)試驗(yàn)的需求。

    圖1 豬基因組DNA提取結(jié)果

    2.2 氟烷基因PCR擴(kuò)增

    從豬耳組織樣品中提取基因組DNA,采用設(shè)計(jì)的引物PCR擴(kuò)增后,用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測均顯示單一明亮條帶,其長度為659 bp的DNA片段 (圖2)。

    圖2 豬Hal基因PCR擴(kuò)增電泳圖譜

    2.3 氟烷基因酶切HhaⅠ-RFLP結(jié)果

    HhaI限制性內(nèi)切酶可識(shí)別野生型HalN基因的5-GCG↓C-3即C位點(diǎn),經(jīng)PCR產(chǎn)物長度為659 bp,當(dāng)氟烷基因未發(fā)生突變時(shí),經(jīng)HhaⅠ酶切后產(chǎn)生兩個(gè)片段,長度分別為493 bp和166 bp,基因型為HalNN;當(dāng)?shù)?843位堿基發(fā)生C→T突變時(shí),不能被HhaⅠ識(shí)別,酶切后只有一個(gè)片段,長度為659 bp,基因型為Halnn;當(dāng)一個(gè)氟烷等位基因發(fā)生突變,而另一個(gè)正常,經(jīng)HhaⅠ酶切后產(chǎn)生3個(gè)片段,分別是659 bp,493 bp和166 bp,基因型為HalNn。

    本次檢測各樣品所獲659 bp的PCR產(chǎn)物,經(jīng)HhaⅠ限制性內(nèi)切酶酶切,均出現(xiàn)大小在493 bp和166 bp被完全切割的兩條條帶,無659 bp條帶殘留(圖3)。

    圖3 豬Hal基因HhaⅠ-RFLP多態(tài)分型結(jié)果

    2.4 豬Hal基因基因型和基因頻率

    由表1可見,所檢測種豬群中NN基因型為1.00,Nn和nn基因型均為0,N基因頻率為1.00,n基因頻率為0。被檢豬群氟烷基因型均為顯性純合子HalNN,未發(fā)現(xiàn)氟烷基因隱性純合子Halnn和氟烷雜合子HalNn,不含有氟烷敏感基因Haln。

    3 小結(jié)與討論

    影響豬肉品質(zhì)的因素主要包括遺傳因素、營養(yǎng)因素和環(huán)境因素,其中遺傳因素是影響豬肉性狀的重要因素之一。DNA標(biāo)記輔助選擇(簡稱MAS)為豬的育種提供了一個(gè)新的突破性方法,豬育種中的若干重要DNA標(biāo)記的理論研究和實(shí)踐應(yīng)用促進(jìn)了豬的育種發(fā)展。PCR-RFLP是目前普遍應(yīng)用的檢測豬氟烷基因方法,采用PCR擴(kuò)增的目的片段,經(jīng)限制性內(nèi)切酶溫育消化后,對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳,根據(jù)酶切片段長度多態(tài)性識(shí)別應(yīng)激敏感豬和抗應(yīng)激豬。

    研究表明[9,10],豬氟烷敏感基因(Haln)具有多效性,一方面導(dǎo)致肌肉肥大,提高胴體瘦肉率;另一方面易誘導(dǎo)發(fā)生 MHS(malignant hyperthermiasy ndrome,惡性高熱綜合征),產(chǎn)生PSE肉,降低肌肉品質(zhì),豬的肉質(zhì)性狀、生長發(fā)育性狀和繁殖性狀都逐漸變劣,而氟烷基因雜合子豬在生產(chǎn)性能和體型外貌上具有雜合優(yōu)勢,更易被選作種用。Pommier 等[11]認(rèn)為 NN、Nn和 nn基因型表現(xiàn)為PSE肉的幾率分別是 53.8%,79.8% 和 90.9%。蔣思文等[12]報(bào)道豬氟烷基因Halnn比HalNN、HalNn雜合子每窩產(chǎn)仔數(shù)和活仔數(shù)少2.0~2.7頭,繁殖性能NN﹥Nn﹥nn;鞠慧萍等[13]研究表明,氟烷敏感基因可導(dǎo)致總產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)和斷奶仔豬數(shù)下降,初生窩重和個(gè)體斷奶重降低,并使生長速度減慢,即Haln對(duì)繁殖性能有較顯著的不良影響。綜合考慮巴克夏豬在我國商品豬繁育體系中的作用,對(duì)Haln基因的利弊進(jìn)行權(quán)衡,認(rèn)為利用成熟的氟烷基因分子標(biāo)記輔助選擇對(duì)巴克夏豬群的Haln基因進(jìn)行剔除,結(jié)合適當(dāng)?shù)倪x育措施,建立抗應(yīng)激豬群,提高種豬質(zhì)量。伍少欽等[2]對(duì)加系長白、加系大白和丹系長白和丹系長白的公豬和母豬的氟烷基因進(jìn)行了檢測,結(jié)果顯示均未發(fā)現(xiàn)隱性純合氟烷基因型(Halnn)和雜合氟烷基因型(HalNn)。宋忠旭等[14]在2005年采用PCR-RFLP方法對(duì)湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所種豬場的大白豬進(jìn)行了氟烷基因的檢測,結(jié)果顯示,檢測的151頭大白豬中基因型均為NN,未檢出Nn和nn基因型。本次試驗(yàn)檢測的156頭巴克夏豬群中基因型均為NN,說明在該良種豬育種場已基本實(shí)現(xiàn)氟烷敏感基因Haln的淘汰,組建了高繁殖力、抗應(yīng)激豬群,為新品系的選育奠定了基礎(chǔ)。

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