HPLC法測(cè)定銀藍(lán)通絡(luò)口服液總黃酮醇苷

李 添，蘇建會(huì)，陳 震，何 珺*

(1.貴州省生化工程中心，貴州 貴陽(yáng)550025;2.桂林紅會(huì)藥業(yè)有限公司，廣西 靈川541200)

銀藍(lán)通絡(luò)口服液以銀杏葉、絞股藍(lán)［1－4］為主藥，加水煎煮，醇沉，濃縮至無(wú)醇味，加入蜂蜜制成。銀杏葉主要活性成分為黃酮醇苷及萜內(nèi)酯，銀杏黃酮醇苷主要能夠增加腦血管流量，改善腦血管循環(huán)功能，保護(hù)腦細(xì)胞，擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈，防止心絞痛及心肌梗塞，防止血栓形成，提高機(jī)體免疫能力。主要用于對(duì)冠心病、心絞痛、腦動(dòng)脈硬化、老年性癡呆、高血壓病人的治療［5－7］。絞股藍(lán)，又名七葉膽、五葉參，主要成分為絞股藍(lán)皂苷(GP)，皂苷、黃酮、多糖、氨基酸、微量元素。具有抑制腫瘤、防止衰老、降低血脂、增強(qiáng)免疫力、鎮(zhèn)靜止痛、保護(hù)心臟和肝臟等作用。銀藍(lán)通絡(luò)口服液具有益氣活血的作用，適用于頭暈，心悸，疲勞等氣虛血瘀證者。

銀藍(lán)通絡(luò)口服液原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，對(duì)于總黃酮主要測(cè)定了其槲皮素醇苷含量，而銀杏黃酮的苷元有7種，即槲皮素、山奈素、異鼠李素、楊梅素、芹菜素、木犀草素、三粒小麥黃酮，而槲皮素、山奈素、異鼠李素三種醇苷是其主要成分，因此，參考2010版中國(guó)藥典采用HPLC測(cè)定銀藍(lán)通絡(luò)液中槲皮素、山奈素、異鼠李素黃酮醇苷含量，該方法可以更準(zhǔn)確測(cè)定銀藍(lán)通絡(luò)口服液中總黃酮含量，從而提升銀藍(lán)通絡(luò)口服液質(zhì)量監(jiān)測(cè)及其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 儀器 分析型HPLC(Agilent 1100)，美國(guó)安捷倫科技公司;C18高效液相色譜柱，Hypersil ODSC18(4.6×150 mm)，大連依利特分析儀器有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(RE－52A)，上海亞榮生化儀器廠;循環(huán)水式多用真空泵(SHB－Ⅲ)，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司;電子天平(BAS124S)，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司;冰箱(BCD－205)，TCL集團(tuán)有限公司;電熱恒溫水浴鍋(HH.SY21－Ni6)，北京長(zhǎng)源實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠;其他為一般常規(guī)儀器。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)材料及試藥 銀藍(lán)通絡(luò)口服液，廣西桂林紅會(huì)藥業(yè)有限公司提供。

對(duì)照品:槲皮素，購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)100081－200907，純度 ＞96.5%;山奈素，購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110861－201209，純度＞93.2%;異鼠李素，購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110860－201109，純度＞99%。

試劑:甲醇，高相液相色譜，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;HCl，分析純，重慶江川化工有限公司;磷酸，分析純，貴陽(yáng)高新技術(shù)開發(fā)區(qū)華通化學(xué)試劑廠;其他試劑均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 高效液相色譜條件 色譜柱:Hypersil ODS C18(4.6 mm×150 mm);流動(dòng)相:甲醇∶水∶磷酸(48∶52∶0.3);流速:0.8 ml/min;檢測(cè)波長(zhǎng):360 nm;柱溫:45℃，進(jìn)樣量:10μL。

1.2.2 對(duì)照品溶液制備 分別精確稱取經(jīng)五氧化二磷干燥過(guò)夜的槲皮素、山奈素、異鼠李素對(duì)照品3.25 mg、2.96 mg、3.05 mg于100 mL容量瓶，加甲醇超聲溶解并定容，搖勻，得到濃度為槲皮素∶山奈素∶異鼠李素=32.5∶29.6∶30.5μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

1.2.3 供試品溶液的制備 樣液的制備:精密量取銀藍(lán)通絡(luò)口服液10 mL置錐形瓶中，加甲醇10 mL和鹽酸1 mL，搖勻，回流2 h，定量轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，過(guò)0.45μm微濾后待測(cè)。

陰性對(duì)照液的制備:取藥方同比例量的蜂蜜加水制成10 mL陰性對(duì)照液，按照樣液制備方法，取陰性對(duì)照前液2 mL于10 mL密封水解管中，加濃鹽酸1 mL，甲醇7 mL搖勻，于68℃恒溫水浴密封水解3小時(shí)，取出冷卻后過(guò)0.45μm微濾后，得到陰性對(duì)照液。

1.2.4 數(shù)據(jù)計(jì)算 參考2010版中國(guó)藥典銀杏葉提取物，總黃酮醇苷=(槲皮素+山奈素+異鼠李素)×2.51。

1.2.5 HPLC圖譜

HPLC圖譜見下圖(圖1～3)。

圖1 混合對(duì)照品HPLC圖譜Flg.1 HPLCchromatogram of the mixed reference substance

圖2 銀藍(lán)通絡(luò)口服液樣品HPLC圖譜Flg.2 HPLCchromatogram of Yin Lan Tong Luo Oral Liquid

圖3 銀藍(lán)通絡(luò)口服液陰性對(duì)照樣HPLC圖譜Flg.3 Negative HPLC chromatogram of Yin Lan Tong Luo Oral Liquid

由上3圖可知:樣品的分離度為3.75、1.62，均大于1.5，所以分離度良好。陰性對(duì)照中3個(gè)黃酮苷元峰幾乎沒有，因此對(duì)銀藍(lán)通絡(luò)口服液中銀杏總黃酮醇苷含量測(cè)定基本無(wú)干擾。

2 方法學(xué)考察

2.1 線性關(guān)系考察

精密吸取2.2對(duì)照品混合溶液2.5μL、5μL、10μL、15μL、20μL，在2.1條件下測(cè)定色譜峰面積，以峰面積積分均值對(duì)對(duì)照品溶液進(jìn)樣量(μg)進(jìn)行線性回歸(n=5)，3種組分的線性范圍、回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表1，由表1可知該方法所測(cè)樣品線性良好。

表1 3種組分線性范圍及回歸方程Tab.1 The linear range and the regression equation of three components

2.2 精密度實(shí)驗(yàn)

取對(duì)照品溶液重復(fù)進(jìn)樣5次，記錄峰面積。結(jié)果表明槲皮素、山奈素和異鼠李素RSD分別為:0.26%、0.24%、0.21%，進(jìn)樣精密度良好。

2.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

將制備好的供試樣液在室溫下貯存，分別于0、2、6、8、24 h進(jìn)行測(cè)定，槲皮素、山奈素、異鼠李素峰面的RSD分別為1.69%、1.49%、1.39%，結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

取同批銀藍(lán)通絡(luò)口服液樣品，按2.3方法平行制備5份，在2.1條件下進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明槲皮素醇苷含量為1.8 mg/支，RSD為1.2%;山奈素醇苷含量為1.77 mg/支，RSD為0.41%，異鼠李素醇苷含量0.71 mg/支，RSD為1.5%，表明該供試品溶液重復(fù)性良好。

2.5 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取同一生產(chǎn)批號(hào)銀藍(lán)通絡(luò)口服液樣品5份，分別加入已知量的槲皮素、山奈素、異鼠李素，按照2.3方法制備后，各份分別在2.1條件下進(jìn)行測(cè)定，求相同添加量的回收率(n=5)，再取其平均值為3種組分的平均回收率，分別為98.25%、94.99%、98.82%，RSD分別為1.03%、0.36%、0.80%，其結(jié)果見表2。

2.6 樣品的測(cè)定

分別精密吸取對(duì)照品溶液、待測(cè)供試品溶液各10μL，按2.1色譜條件上機(jī)，以峰面積按外標(biāo)法計(jì)算含量，結(jié)果如表3所示。

表2 3種黃酮組分添加回收率(n=5)Tab.2 The recovery rate of three compounds(n=5)

表3 銀藍(lán)通絡(luò)口服液中總黃酮醇苷含量(mg/支)Tab.3 Ginkgo flavonoids glycol glycosides content in YIN LAN TONG LUO oral liquid

由上表可知:3批次銀藍(lán)通絡(luò)口服液，且均達(dá)到槲皮素醇苷含量不少于1.1 mg/支的標(biāo)準(zhǔn)，山奈素醇苷含量在1.76～1.77 mg/支，異鼠李素醇苷含量在0.69～0.71 mg/支，總黃酮醇苷在4.24～4.29 mg/支。通過(guò)該實(shí)驗(yàn)方法，測(cè)定了總黃酮醇苷含量，且3個(gè)批次含量穩(wěn)定。

3 總結(jié)

3.1 在對(duì)樣品進(jìn)行含量測(cè)定的過(guò)程中，供試品溶液需要酸水解成苷元進(jìn)行檢測(cè)，一般在銀藍(lán)通絡(luò)口服液樣液水解后12 h內(nèi)檢測(cè)，以免成分再分解，影響含量測(cè)定結(jié)果。

3.2 HPLC測(cè)定的流動(dòng)相中加入少量醋酸或磷酸可有效改善峰形，因此，對(duì)流動(dòng)相的比例進(jìn)行調(diào)整后，經(jīng)試驗(yàn)，甲醇∶水∶磷酸(48∶52∶0.3)體系可使待測(cè)組分的分離度較好。

3.3 原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定時(shí)，只測(cè)定了槲皮素醇苷的含量，現(xiàn)參考2010版中國(guó)藥典中銀杏葉提取物，通過(guò)該實(shí)驗(yàn)提升了銀藍(lán)通絡(luò)口服液中總黃酮的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，即由原來(lái)銀藍(lán)通絡(luò)口服液中槲皮素醇苷不得少于1.10 mg/支，優(yōu)化為測(cè)定槲皮素、山奈素及異鼠李素3種黃酮醇苷的監(jiān)測(cè) ，更準(zhǔn)確地反應(yīng)了銀藍(lán)通絡(luò)口服液中藥效成分總黃酮醇苷含量。

綜上所述，該方法可以準(zhǔn)確測(cè)定銀藍(lán)通絡(luò)口服液中總黃酮醇苷含量，且陰性樣品無(wú)干擾。同時(shí)對(duì)銀藍(lán)通絡(luò)口服液中槲皮素，山奈素及異鼠李素3種黃酮醇苷進(jìn)行了監(jiān)測(cè)，替代原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中只監(jiān)測(cè)槲皮素醇苷的含量，更準(zhǔn)確地反應(yīng)了銀藍(lán)通絡(luò)口服液中總黃酮醇苷含量。

［1］王林麗，汪潔筠.絞股藍(lán)藥理作用及臨床應(yīng)用進(jìn)展［J］中醫(yī)藥信息，2002，19(4):11－14.

［2］郭生楨.絞股藍(lán)研究進(jìn)展［J］.中草藥，1987，18(7):37－40.

［3］朱文婷，王田光，絞股藍(lán)研究的現(xiàn)狀［J］.中醫(yī)藥信息，1989，1:43.

［4］劉錦業(yè)，殷 銘，劉遠(yuǎn)軍，等.復(fù)方絞股藍(lán)口服液的研制［J］.中成藥，2005，27(1):124－125.

［5］國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典:1部［M］.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:296－297.

［6］宋立人，洪 恂，丁緒亮，等.現(xiàn)代中藥學(xué)大辭典:下冊(cè)［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2001:2 212－2 214.

［7］田代華.實(shí)用中藥辭典:下卷［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2002:2 032－2 033.