豬木乃伊胎病原體混合感染的多重PCR診斷

王偉丞，劉志杰，梁海英，曾智勇*，湯德元，劉 釗

（1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；2. 貴州大學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)場(chǎng)，貴州 貴陽(yáng) 550025）

豬圓環(huán)病毒2型感染引起的病毒性疾病，主要與斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征等疾病有關(guān)，如豬皮炎腎病綜合征、豬增生性壞死性肺炎、新生仔豬的先天性震顫、豬呼吸道綜合癥、肉芽腫性腸炎、母豬繁殖障礙等，這些疾病對(duì)豬的生長(zhǎng)、發(fā)育和死亡有較大影響[1]。乙型腦炎是由乙型腦炎病毒引起的一種嚴(yán)重威脅人畜健康的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的急性傳染病，豬是JEV最重要的自然增殖動(dòng)物，發(fā)病豬多出現(xiàn)高熱，精神沉郁或神經(jīng)癥狀，食欲減退，有的出現(xiàn)后肢麻痹、視力減退、搖擺、亂沖撞等癥狀，同時(shí)JEV也是導(dǎo)致豬繁殖障礙的重要病原之一[2]。2013年11月，貴州省都勻市某豬場(chǎng)，共有母豬300頭左右，近1個(gè)月內(nèi)，30頭初產(chǎn)母豬中有20頭出現(xiàn)流產(chǎn)，產(chǎn)死胎、木乃伊胎和弱仔現(xiàn)象，母豬無(wú)其他明顯癥狀，該豬場(chǎng)配種前1個(gè)月曾免疫PRV、PPV、PRRSV、CSFV和JEV疫苗。為查清豬群發(fā)病原因，試驗(yàn)選用豬繁殖障礙性病毒性疫病六重PCR檢測(cè)方法[3]，對(duì)送檢的1頭木乃伊胎進(jìn)行了PRV、PPV、PCV2、PRRSV、CFSV和JEV感染情況的快速診斷，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 病料

采集送檢木乃伊胎的肺臟、脾臟、淋巴結(jié)和腦組織等置于乳缽剪碎后用PBS按1:5倍稀釋研磨，制成乳懸液，-80 ℃反復(fù)凍融3次，12 000 r/min離心10 min，取上清于 -20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑

核酸提取試劑盒；PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver.2.0、DL2000購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；DNA凝膠回收試劑盒；pMD19-T Simple Vector；普通質(zhì)粒小提試劑盒為TIANGEN公司產(chǎn)品；其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成

根 據(jù)NCBI公 布PRV gE（NC-006151）、PPV NS1（NC-001718）、PCV2 ORF2 (NC-005148）、PRRSV ORF5 (NC-001961)、CFSV E2（X87939）、JEV E(M55506)序列設(shè)計(jì)多重PCR引物，預(yù)期的擴(kuò)增目的片段長(zhǎng)度為178 bp、271 bp、353 bp、433 bp、508 bp和1 015 bp。

1.4 病料中DNA/RNA的抽提

嚴(yán)格按TaKaRa公司核酸提取試劑盒說(shuō)明書提取病料中的核酸。

1.5 多重PCR擴(kuò)增

以病料核酸為模版進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為50μL， 2×1StepBuffer 25μL， 核 酸 模 版 5μL，PrimeScript one Step Enzyme Mix 2μL，上下游引物各1μL，共6對(duì)引物，RNase Free H2O 6μL。反應(yīng)條件：50 ℃ 40 min，94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s ，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35 個(gè)循環(huán) ；72 ℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。將經(jīng)膠回收純化的PCR產(chǎn)物與pMD 19-T Simple載體按常規(guī)方法進(jìn)行連接并轉(zhuǎn)化至Top10感受態(tài)細(xì)胞。挑取白色菌落進(jìn)行增菌培養(yǎng)，小劑量試劑盒提取質(zhì)粒DNA，用質(zhì)粒PCR進(jìn)行鑒定，并將陽(yáng)性克隆質(zhì)粒送大連寶生物公司測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 解剖病理變化

送檢的木乃伊胎兒全身肌肉褪色，內(nèi)臟組織粘連、腐化，腦組織液化。

2.2 多重PCR擴(kuò)增結(jié)果

應(yīng)用已建立的六重PCR檢測(cè)技術(shù)，對(duì)送檢的1份病料進(jìn)行快速檢測(cè)，擴(kuò)增出了353 bp和1 015 bp左右大小的特異性條帶（圖2），擴(kuò)增的目的條帶，經(jīng)克隆測(cè)序，再次證實(shí)其分別為PCV2及JEV基因組片段；結(jié)果表明，該病死仔豬同時(shí)感染有PCV2和JEV兩種病毒。

3 討論

從發(fā)病情況、病料剖解及實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，確診該豬場(chǎng)送檢的木乃伊胎病料同時(shí)感染有豬圓環(huán)病毒2型和豬乙型腦炎病毒。該病例中發(fā)生繁殖障礙的均是初產(chǎn)母豬，且母豬本身無(wú)明顯癥狀，因此疑似感染有豬細(xì)小病毒，但通過(guò)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，未檢出PPV，表明僅通過(guò)臨床癥狀和病理變化很難對(duì)豬場(chǎng)疫情做出確診，確診仍需借助實(shí)驗(yàn)室診斷。

雖然該豬場(chǎng)的母豬都進(jìn)行了JEV疫苗的接種，但仍然受到JEV的侵襲，免疫失敗的原因可能是該豬場(chǎng)母豬存在JEV的隱性感染，加上豬群中存在PCV2的野毒感染，PCV2可造成豬體免疫抑制，從而使JEV疫苗免疫失敗，豬群暴發(fā)JEV。據(jù)相關(guān)研究表明，JEV在貴州地區(qū)隱性感染比較嚴(yán)重，感染率達(dá)59.97%，其潛在的危害不可忽視，疫苗免疫能夠有效防控本病[4]。豬群中感染PCV2 也較為普遍，但真正發(fā)病或者表現(xiàn)臨床癥狀的較少，且其疫苗價(jià)格較高，出于經(jīng)濟(jì)利益考慮，很多養(yǎng)殖戶未給豬群免疫PCV2疫苗，但本病例中從木乃伊胎兒檢出PCV2，表明該病毒可通過(guò)胎盤垂直傳播而感染仔豬，但仔豬感染后發(fā)病較嚴(yán)重，再與其他病毒或細(xì)菌繼發(fā)或并發(fā)感染，可造成仔豬群大量死亡。近年來(lái)，豬群多病原體混合感染越發(fā)普遍，其中影響最大的就是PRRSV和PCV2的混合感染，因此豬場(chǎng)在做好PRV、PRRSV、CSFV疫苗免疫的同時(shí)，需重視對(duì)PCV2的防控，豬群接種PCV2疫苗可有效降低發(fā)病率和死亡率，在提高飼料報(bào)酬和增重、豬群整齊度等方面有明顯的效果，因此建議有條件的豬場(chǎng)免疫PCV2疫苗。

PCR方法在疾病診斷上具有操作簡(jiǎn)便、快速、特異性好、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，本試驗(yàn)采用的多重PCR能夠同時(shí)檢測(cè)多種病原，利于對(duì)疾病做出快速準(zhǔn)確的診斷，適合大量臨床病料中病原體的快速檢測(cè)，具有較大的應(yīng)用價(jià)值。

圖1 病料解剖病理變化

圖2 病料多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果

[1]喬翠，高鳳山，許崇波.豬圓環(huán)病毒2型分子致病機(jī)理及相關(guān)疾病研究進(jìn)展[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī).2012，39(2):170-173.

[2]湯德元，王鳳，馬萍，等. 乙型腦炎病毒貴州分離株E基因原核表達(dá)及其免疫原性的研究[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2012，43(8): 1330-1336.

[3]劉志杰，曾智勇，湯德元，等. 豬繁殖障礙病毒性疫病六重PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2012，43(9):1429-1436.

[4]程振濤，陳軍義，岳筠，等.貴州省豬乙型腦炎血清流行病學(xué)調(diào)查[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào).2011，27(12):1156-1158.