野生大草烏中總黃酮的提取與抗氧化性分析

李泉+王寶森+劉貴陽+閆勇+唐明宇+李德

摘要：以石油醚脫脂、乙醇回流提取云南個舊野生大草烏（Aconitum vilmorinianum）中總黃酮，以蘆丁為對照用紫外分光光度法測定了大草烏中總黃酮含量，研究了不同乙醇體積分數(shù)、回流時間對總黃酮提取的影響，采用鄰苯三酚自氧化測定其抗氧化性。結(jié)果表明，用70%乙醇回流提取3 h，大草烏總黃酮含量最高，為1.457%。大草烏總黃酮對超氧陰離子自由基有明顯的清除作用，清除率為34.49%。

關(guān)鍵詞：野生大草烏（Aconitum vilmorinianum）；總黃酮；乙醇回流提取；紫外分光光度法；抗氧化性

中圖分類號：R282；S188 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）17-4142-03

Extraction of Total Flavonoids in Aconitum vilmorinianum

and Its Anti-Oxidation

LI Quan1，WANG Bao-sen2， LIU Gui-yang2， YAN Yong2， TANG Ming-yu1， LI De1

（1.Yunnan Tin Vocational & Technical College， Gejiu 661000， Yunnan， China；

2.School of Science， Honghe University， Mengzi 661100， Yunnan， China）

Abstract： Total flavonoids of wild Aconitum vilmorinianum in Gejiu city， Yunnan province were extracted with petroleum ether derosination and ethanol circumfluence. The content of total flavonoids in Aconitum vilmorinianum were detected with ultraviolet spectrophotometry using rutin as reference. The effects of ethanol concentrations and circumfluence times on the extraction of total flavonoids were studied. The anti-oxidation of total flavonoids was investigated by spontaneous oxidation of pyrogallol. Results showed that， the content of total flavonoids in Aconitum vilmorinianum was about 1.457% when it was extracted by 70% ethanol circumfluence for 3 hours. The total flavonoids in Aconitum vilmorinianum had obviously eliminating action to superoxide anion free radicals， with a clearance of 34.49%.

Key words： Aconitum vilmorinianum； total flavonoids； ethanol circumfluence extraction； ultraviolet spectrophotometry； oxidation resistance

大草烏（Aconitum vilmorinianum）為毛茛科植物黃草烏和膝瓣烏頭的塊根，主要分布于四川會理、貴州西部和云南中部，具有祛風(fēng)散寒、活血止痛、解毒消腫的功效，主治風(fēng)寒濕痹、手足厥冷、跌打損傷和瘡毒[1]。大草烏有毒且苦，在云南種植及應(yīng)用廣泛，屬于菜藥兼用植物。

黃酮類化合物是自然界中一類重要的天然有機化合物，廣泛存在于藥用植物、水果和蔬菜中，特別是在高等植物的花、葉、根中較多[2]。黃酮類化合物具有多種生物活性，有抗?jié)儭⒖惯^敏、抗菌、抗炎、抗氧化、降血脂、治療心腦血管疾病等功能。隨著研究方法的不斷更新和改進，新的黃酮類化合物不斷被發(fā)現(xiàn)，其應(yīng)用更加廣泛[3]。目前，對大草烏的分析研究報道較少，為進一步開發(fā)大草烏的藥用價值，本研究對野生大草烏中總黃酮的提取與抗氧化性進行分析，旨在為大草烏的研究與推廣應(yīng)用，以及推進藥用植物的發(fā)展提供科學(xué)的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

野生大草烏購于云南省紅河州個舊市集市，產(chǎn)地為個舊市老廠鎮(zhèn)。大草烏樣品先用去離子水沖洗干凈，在105 ℃烘干，然后研細備用。

1.2 儀器與試劑

UV-4802S型紫外-可見分光光度計（上海尤尼柯儀器有限公司）；BS224S型電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；OSB-2100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛朗儀器有限公司）；TDL80-2B型臺式離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；恒溫烘箱；恒溫水浴鍋；索氏提取器；粉粹機。

蘆丁對照品、無水乙醇、石油醚（60～90 ℃）、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、鄰苯三酚、Tris等試劑均為分析純；鹽酸為優(yōu)級純；試驗用水為去離子水。

1.3 大草烏總黃酮的提取

1.3.1 不同體積分數(shù)乙醇對大草烏總黃酮提取的影響 分別準確稱取4.000 0 g干燥的大草烏粉末6份，用濾紙包好后置于索氏提取器中，用100 mL石油醚在80 ℃條件下回流5 h，取除脂后的大草烏在60 ℃下烘干，分別用100 mL 40%、50%、60%、70%、80%、90%乙醇溶液在85 ℃條件下回流2次，每次3 h，合并濾液后抽濾，55 ℃減壓蒸餾至無醇味，4 800 r/min離心15 min，將上清液轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，分別用相應(yīng)體積分數(shù)的乙醇定容，得到大草烏總黃酮提取液[4-9]。endprint

1.3.2 不同回流時間對大草烏總黃酮提取的影響 分別準確稱取4.000 0 g干燥的大草烏粉末5份，用濾紙包好后置于索氏提取器中，用100 mL石油醚在80 ℃條件下回流5 h，取除脂后的大草烏在60 ℃下烘干，用100 mL 70%乙醇溶液在85 ℃條件下回流2次，回流時間分別為1、2、3、4、5 h，合并濾液后抽濾，55 ℃減壓蒸餾至無醇味，在4 800 r/min離心15 min，將上清液轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用70%乙醇定容，得到大草烏總黃酮提取液。

1.4 分析方法

1.4.1 波長的選擇 將標準溶液和樣品溶液以乙醇為空白對照，在波長200～800 nm進行掃描，結(jié)果顯示標準溶液和樣品溶液在波長510 nm處有最大吸收，故選定510 nm為測定波長。

1.4.2 標準曲線的繪制 精確稱取蘆丁對照品5 mg，用60%乙醇溶解，并轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，加60%乙醇至刻度，搖勻，得到濃度為0.100 0 mg/mL的標準溶液。精確吸取蘆丁標準溶液0、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL，分別置于10 mL比色管（此處試驗所用儀器為比色管，用分光光度計測定時用比色皿）中，各加60%乙醇至5 mL，再分別加入5%（質(zhì)量分數(shù)，下同）的NaNO2溶液0.50 mL，搖勻，室溫放置6 min，加10%的Al（NO3）3溶液0.50 mL搖勻，室溫放置6 min，加4%的NaOH溶液 4.00 mL搖勻，室溫放置15 min，用紫外-可見分光光度計在510 nm波長下測定吸光度，同時以試劑空白作參比。以吸光度A為縱坐標，蘆丁濃度C為橫坐標，繪制標準曲線。

1.4.3 總黃酮含量的測定 準確吸取總黃酮提取液1.00 mL，置于10 mL比色管（此處試驗所用儀器為比色管，用分光光度計測定時用比色皿）中，補加相應(yīng)體積分數(shù)的乙醇至5 mL，其他步驟按“1.4.2”的方法操作，在510 nm波長下平行測定3次。根據(jù)回歸方程，計算總黃酮濃度。根據(jù)公式：總黃酮含量=[提取液濃度（mg/mL）×稀釋倍數(shù)×體積（mL）/樣品干重（g）×1 000]×100%，計算大草烏總黃酮含量。

1.5 清除超氧陰離子自由基能力的測定

取4.5 mL 50 mmol/L的Tris-HCl緩沖溶液，加4.2 mL去離子水混勻后在25 ℃水浴中保溫20 min，取出后立即加入在25 ℃預(yù)熱過的3 mmol/L鄰苯三酚0.3 mL，迅速搖勻后倒入比色皿，420 nm波長下每隔30 s測定吸光度，以10 mmol/L的HCl代替鄰苯三酚作為空白對照。

按照上述操作步驟在加入鄰苯三酚前先加入0.1 mL的總黃酮提取液，同樣用10 mmol/L的HCl作空白對照，測定吸光度，并按以下公式計算清除率：

超氧陰離子自由基清除率=（A1-A2）/A1×100%

式中，A1為鄰苯三酚自氧化平均吸光度；A2為加入樣品后鄰苯三酚自氧化平均吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線的繪制

以吸光度A為縱坐標，蘆丁濃度C為橫坐標， 繪制標準曲線，所得標準曲線如圖1所示。所得回歸方程為A=7.714 3C+0.004 3，R2=0.997 4。

2.2 不同體積分數(shù)乙醇對大草烏總黃酮提取的影響

由表1可知，不同體積分數(shù)的乙醇提取得到的大草烏總黃酮的含量不同，乙醇體積分數(shù)從40%升高到70%時，隨著乙醇體積分數(shù)的增大，大草烏總黃酮的含量也逐漸增大；乙醇體積分數(shù)從70%升高到90%時，隨著乙醇體積分數(shù)的增大，大草烏總黃酮的含量稍有減小，70%乙醇提取的大草烏總黃酮含量最高，達1.456%。說明，大草烏中的總黃酮一部分為脂溶性，部分為水溶性（大草烏水提取液能與氯化鐵反應(yīng)顯示出較深的顏色）。

2.3 不同回流時間對大草烏總黃酮提取的影響

由表2可知，不同回流時間對大草烏總黃酮提取的影響不同?；亓?～3 h時，隨著回流時間的增長，大草烏總黃酮的含量逐漸增大；回流時間3～5 h，隨著回流時間延長，大草烏總黃酮的含量有所減小，3 h時大草烏總黃酮含量最高，達1.457%?？赡苁腔亓鲿r間過長會提取出其他成分與黃酮相互作用，使提取的總黃酮含量降低。

以上分析結(jié)果可知，用70%乙醇回流提取3 h，大草烏總黃酮含量最高。在此條件下，通過3次平行試驗測定得到大草烏總黃酮含量為1.457%。

2.4 大草烏黃酮對超氧陰離子自由基的清除作用

通過測定，大草烏總黃酮對超氧陰離子自由基有明顯的清除作用，清除率達到34.49%。說明大草烏總黃酮具有一定的抗氧化作用。由此可見，大草烏具有較高的藥用價值。

3 小結(jié)與討論

采用不同體積分數(shù)乙醇對大草烏總黃酮進行提取，大草烏中的總黃酮一部分為脂溶性，部分為水溶性，這與羅晶[10]對紅景天分析的結(jié)果一致。本試驗結(jié)果中測定的大草烏總黃酮含量為1.457%，與畢和平等[11]分析的穿心蓮結(jié)果比較，大草烏中總黃酮含量比穿心蓮的高，與劉偉玲[12]分析的刺五加葉中總黃酮的結(jié)果比較，大草烏中總黃酮含量則比刺五加葉中的低。說明不同藥用植物中總黃酮含量不同。

本試驗結(jié)果表明，以石油醚脫脂、乙醇回流可提取野生大草烏中總黃酮，提取的最佳條件為乙醇體積分數(shù)70%，回流提取時間3 h，此條件下提取的野生大草烏中總黃酮含量最高，達到1.457%。大草烏總黃酮對超氧陰離子自由基有明顯的清除作用，清除率為34.49%，說明大草烏總黃酮具有一定的抗氧化作用，且具有較高的藥用價值。

參考文獻：

[1] 昆明軍區(qū)勤部衛(wèi)生部.云南中草藥選[M].天津：天津人民出版社，1970.

[2] 劉玉芬，夏海濤，楊樹平.紫外分光光度法測定劍麻花中總黃酮的含量[J].食品科學(xué)，2005，26（9）：418-419.

[3] 李 靜，王成永，張婷婷，等.木瓜中總黃酮成分的提取和含量測定[J]. 中醫(yī)藥臨床雜志，2008，20（6）：617-619.

[4] 梁新紅，趙功玲，趙瑞香.分光光度法測定仙人掌酒中總黃酮含量[J].中國釀造，2007（6）：67-69.

[5] 苗 方，侯剛健，安 蕓，等.分光光度法對銀杏茶中總黃酮的含量測定[J].醫(yī)學(xué)理論與實踐，2009，22（3）：359-360.

[6] 朱 紅，鈕福祥，張愛君，等.甘薯葉中黃酮類化合物提取工藝研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006（5）：154-156.

[7] 鄭津輝，王 威，黃 輝.苦參提取液中黃酮類化合物的抑菌作用[J].武漢大學(xué)學(xué)報（理學(xué)版），2008，54（4）：439-442.

[8] 唐 敏，劉 耀，王 渝，等.金銀花總黃酮粗提物體外抑菌作用研究[J].中國藥房，2008，19（30）：2321-2323.

[9] 董 捷，張紅城，秦 健，等.十種蜂花粉醇提物中總多酚和總黃酮含量測定[J].食品科學(xué)，2008，29（12）：246-249.

[10] 羅 晶.薔薇紅景天總黃酮的提取及分析[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（35）：15546-15547.

[11] 畢和平，韓長日，廖家旺，等.穿心蓮中總黃酮含量的測定[J]. 光譜實驗室，2006，23（2）：356-359.

[12] 劉偉玲.刺五加葉中的主要活性成分分析[J].中醫(yī)藥導(dǎo)報，2009，15（7）：87-88.endprint

1.3.2 不同回流時間對大草烏總黃酮提取的影響 分別準確稱取4.000 0 g干燥的大草烏粉末5份，用濾紙包好后置于索氏提取器中，用100 mL石油醚在80 ℃條件下回流5 h，取除脂后的大草烏在60 ℃下烘干，用100 mL 70%乙醇溶液在85 ℃條件下回流2次，回流時間分別為1、2、3、4、5 h，合并濾液后抽濾，55 ℃減壓蒸餾至無醇味，在4 800 r/min離心15 min，將上清液轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用70%乙醇定容，得到大草烏總黃酮提取液。

1.4 分析方法

1.4.1 波長的選擇 將標準溶液和樣品溶液以乙醇為空白對照，在波長200～800 nm進行掃描，結(jié)果顯示標準溶液和樣品溶液在波長510 nm處有最大吸收，故選定510 nm為測定波長。

1.4.2 標準曲線的繪制 精確稱取蘆丁對照品5 mg，用60%乙醇溶解，并轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，加60%乙醇至刻度，搖勻，得到濃度為0.100 0 mg/mL的標準溶液。精確吸取蘆丁標準溶液0、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL，分別置于10 mL比色管（此處試驗所用儀器為比色管，用分光光度計測定時用比色皿）中，各加60%乙醇至5 mL，再分別加入5%（質(zhì)量分數(shù)，下同）的NaNO2溶液0.50 mL，搖勻，室溫放置6 min，加10%的Al（NO3）3溶液0.50 mL搖勻，室溫放置6 min，加4%的NaOH溶液 4.00 mL搖勻，室溫放置15 min，用紫外-可見分光光度計在510 nm波長下測定吸光度，同時以試劑空白作參比。以吸光度A為縱坐標，蘆丁濃度C為橫坐標，繪制標準曲線。

1.4.3 總黃酮含量的測定 準確吸取總黃酮提取液1.00 mL，置于10 mL比色管（此處試驗所用儀器為比色管，用分光光度計測定時用比色皿）中，補加相應(yīng)體積分數(shù)的乙醇至5 mL，其他步驟按“1.4.2”的方法操作，在510 nm波長下平行測定3次。根據(jù)回歸方程，計算總黃酮濃度。根據(jù)公式：總黃酮含量=[提取液濃度（mg/mL）×稀釋倍數(shù)×體積（mL）/樣品干重（g）×1 000]×100%，計算大草烏總黃酮含量。

1.5 清除超氧陰離子自由基能力的測定

取4.5 mL 50 mmol/L的Tris-HCl緩沖溶液，加4.2 mL去離子水混勻后在25 ℃水浴中保溫20 min，取出后立即加入在25 ℃預(yù)熱過的3 mmol/L鄰苯三酚0.3 mL，迅速搖勻后倒入比色皿，420 nm波長下每隔30 s測定吸光度，以10 mmol/L的HCl代替鄰苯三酚作為空白對照。

按照上述操作步驟在加入鄰苯三酚前先加入0.1 mL的總黃酮提取液，同樣用10 mmol/L的HCl作空白對照，測定吸光度，并按以下公式計算清除率：

超氧陰離子自由基清除率=（A1-A2）/A1×100%

式中，A1為鄰苯三酚自氧化平均吸光度；A2為加入樣品后鄰苯三酚自氧化平均吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線的繪制

以吸光度A為縱坐標，蘆丁濃度C為橫坐標， 繪制標準曲線，所得標準曲線如圖1所示。所得回歸方程為A=7.714 3C+0.004 3，R2=0.997 4。

2.2 不同體積分數(shù)乙醇對大草烏總黃酮提取的影響

由表1可知，不同體積分數(shù)的乙醇提取得到的大草烏總黃酮的含量不同，乙醇體積分數(shù)從40%升高到70%時，隨著乙醇體積分數(shù)的增大，大草烏總黃酮的含量也逐漸增大；乙醇體積分數(shù)從70%升高到90%時，隨著乙醇體積分數(shù)的增大，大草烏總黃酮的含量稍有減小，70%乙醇提取的大草烏總黃酮含量最高，達1.456%。說明，大草烏中的總黃酮一部分為脂溶性，部分為水溶性（大草烏水提取液能與氯化鐵反應(yīng)顯示出較深的顏色）。

2.3 不同回流時間對大草烏總黃酮提取的影響

由表2可知，不同回流時間對大草烏總黃酮提取的影響不同?；亓?～3 h時，隨著回流時間的增長，大草烏總黃酮的含量逐漸增大；回流時間3～5 h，隨著回流時間延長，大草烏總黃酮的含量有所減小，3 h時大草烏總黃酮含量最高，達1.457%?？赡苁腔亓鲿r間過長會提取出其他成分與黃酮相互作用，使提取的總黃酮含量降低。

以上分析結(jié)果可知，用70%乙醇回流提取3 h，大草烏總黃酮含量最高。在此條件下，通過3次平行試驗測定得到大草烏總黃酮含量為1.457%。

2.4 大草烏黃酮對超氧陰離子自由基的清除作用

通過測定，大草烏總黃酮對超氧陰離子自由基有明顯的清除作用，清除率達到34.49%。說明大草烏總黃酮具有一定的抗氧化作用。由此可見，大草烏具有較高的藥用價值。

3 小結(jié)與討論

采用不同體積分數(shù)乙醇對大草烏總黃酮進行提取，大草烏中的總黃酮一部分為脂溶性，部分為水溶性，這與羅晶[10]對紅景天分析的結(jié)果一致。本試驗結(jié)果中測定的大草烏總黃酮含量為1.457%，與畢和平等[11]分析的穿心蓮結(jié)果比較，大草烏中總黃酮含量比穿心蓮的高，與劉偉玲[12]分析的刺五加葉中總黃酮的結(jié)果比較，大草烏中總黃酮含量則比刺五加葉中的低。說明不同藥用植物中總黃酮含量不同。

本試驗結(jié)果表明，以石油醚脫脂、乙醇回流可提取野生大草烏中總黃酮，提取的最佳條件為乙醇體積分數(shù)70%，回流提取時間3 h，此條件下提取的野生大草烏中總黃酮含量最高，達到1.457%。大草烏總黃酮對超氧陰離子自由基有明顯的清除作用，清除率為34.49%，說明大草烏總黃酮具有一定的抗氧化作用，且具有較高的藥用價值。

參考文獻：

[1] 昆明軍區(qū)勤部衛(wèi)生部.云南中草藥選[M].天津：天津人民出版社，1970.

[2] 劉玉芬，夏海濤，楊樹平.紫外分光光度法測定劍麻花中總黃酮的含量[J].食品科學(xué)，2005，26（9）：418-419.

[3] 李 靜，王成永，張婷婷，等.木瓜中總黃酮成分的提取和含量測定[J]. 中醫(yī)藥臨床雜志，2008，20（6）：617-619.

[4] 梁新紅，趙功玲，趙瑞香.分光光度法測定仙人掌酒中總黃酮含量[J].中國釀造，2007（6）：67-69.

[5] 苗 方，侯剛健，安 蕓，等.分光光度法對銀杏茶中總黃酮的含量測定[J].醫(yī)學(xué)理論與實踐，2009，22（3）：359-360.

[6] 朱 紅，鈕福祥，張愛君，等.甘薯葉中黃酮類化合物提取工藝研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006（5）：154-156.

[7] 鄭津輝，王 威，黃 輝.苦參提取液中黃酮類化合物的抑菌作用[J].武漢大學(xué)學(xué)報（理學(xué)版），2008，54（4）：439-442.

[8] 唐 敏，劉 耀，王 渝，等.金銀花總黃酮粗提物體外抑菌作用研究[J].中國藥房，2008，19（30）：2321-2323.

[9] 董 捷，張紅城，秦 健，等.十種蜂花粉醇提物中總多酚和總黃酮含量測定[J].食品科學(xué)，2008，29（12）：246-249.

[10] 羅 晶.薔薇紅景天總黃酮的提取及分析[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（35）：15546-15547.

[11] 畢和平，韓長日，廖家旺，等.穿心蓮中總黃酮含量的測定[J]. 光譜實驗室，2006，23（2）：356-359.

[12] 劉偉玲.刺五加葉中的主要活性成分分析[J].中醫(yī)藥導(dǎo)報，2009，15（7）：87-88.endprint

1.3.2 不同回流時間對大草烏總黃酮提取的影響 分別準確稱取4.000 0 g干燥的大草烏粉末5份，用濾紙包好后置于索氏提取器中，用100 mL石油醚在80 ℃條件下回流5 h，取除脂后的大草烏在60 ℃下烘干，用100 mL 70%乙醇溶液在85 ℃條件下回流2次，回流時間分別為1、2、3、4、5 h，合并濾液后抽濾，55 ℃減壓蒸餾至無醇味，在4 800 r/min離心15 min，將上清液轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用70%乙醇定容，得到大草烏總黃酮提取液。

1.4 分析方法

1.4.1 波長的選擇 將標準溶液和樣品溶液以乙醇為空白對照，在波長200～800 nm進行掃描，結(jié)果顯示標準溶液和樣品溶液在波長510 nm處有最大吸收，故選定510 nm為測定波長。

1.4.2 標準曲線的繪制 精確稱取蘆丁對照品5 mg，用60%乙醇溶解，并轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，加60%乙醇至刻度，搖勻，得到濃度為0.100 0 mg/mL的標準溶液。精確吸取蘆丁標準溶液0、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL，分別置于10 mL比色管（此處試驗所用儀器為比色管，用分光光度計測定時用比色皿）中，各加60%乙醇至5 mL，再分別加入5%（質(zhì)量分數(shù)，下同）的NaNO2溶液0.50 mL，搖勻，室溫放置6 min，加10%的Al（NO3）3溶液0.50 mL搖勻，室溫放置6 min，加4%的NaOH溶液 4.00 mL搖勻，室溫放置15 min，用紫外-可見分光光度計在510 nm波長下測定吸光度，同時以試劑空白作參比。以吸光度A為縱坐標，蘆丁濃度C為橫坐標，繪制標準曲線。

1.4.3 總黃酮含量的測定 準確吸取總黃酮提取液1.00 mL，置于10 mL比色管（此處試驗所用儀器為比色管，用分光光度計測定時用比色皿）中，補加相應(yīng)體積分數(shù)的乙醇至5 mL，其他步驟按“1.4.2”的方法操作，在510 nm波長下平行測定3次。根據(jù)回歸方程，計算總黃酮濃度。根據(jù)公式：總黃酮含量=[提取液濃度（mg/mL）×稀釋倍數(shù)×體積（mL）/樣品干重（g）×1 000]×100%，計算大草烏總黃酮含量。

1.5 清除超氧陰離子自由基能力的測定

取4.5 mL 50 mmol/L的Tris-HCl緩沖溶液，加4.2 mL去離子水混勻后在25 ℃水浴中保溫20 min，取出后立即加入在25 ℃預(yù)熱過的3 mmol/L鄰苯三酚0.3 mL，迅速搖勻后倒入比色皿，420 nm波長下每隔30 s測定吸光度，以10 mmol/L的HCl代替鄰苯三酚作為空白對照。

按照上述操作步驟在加入鄰苯三酚前先加入0.1 mL的總黃酮提取液，同樣用10 mmol/L的HCl作空白對照，測定吸光度，并按以下公式計算清除率：

超氧陰離子自由基清除率=（A1-A2）/A1×100%

式中，A1為鄰苯三酚自氧化平均吸光度；A2為加入樣品后鄰苯三酚自氧化平均吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線的繪制

以吸光度A為縱坐標，蘆丁濃度C為橫坐標， 繪制標準曲線，所得標準曲線如圖1所示。所得回歸方程為A=7.714 3C+0.004 3，R2=0.997 4。

2.2 不同體積分數(shù)乙醇對大草烏總黃酮提取的影響

由表1可知，不同體積分數(shù)的乙醇提取得到的大草烏總黃酮的含量不同，乙醇體積分數(shù)從40%升高到70%時，隨著乙醇體積分數(shù)的增大，大草烏總黃酮的含量也逐漸增大；乙醇體積分數(shù)從70%升高到90%時，隨著乙醇體積分數(shù)的增大，大草烏總黃酮的含量稍有減小，70%乙醇提取的大草烏總黃酮含量最高，達1.456%。說明，大草烏中的總黃酮一部分為脂溶性，部分為水溶性（大草烏水提取液能與氯化鐵反應(yīng)顯示出較深的顏色）。

2.3 不同回流時間對大草烏總黃酮提取的影響

由表2可知，不同回流時間對大草烏總黃酮提取的影響不同。回流1～3 h時，隨著回流時間的增長，大草烏總黃酮的含量逐漸增大；回流時間3～5 h，隨著回流時間延長，大草烏總黃酮的含量有所減小，3 h時大草烏總黃酮含量最高，達1.457%?？赡苁腔亓鲿r間過長會提取出其他成分與黃酮相互作用，使提取的總黃酮含量降低。

以上分析結(jié)果可知，用70%乙醇回流提取3 h，大草烏總黃酮含量最高。在此條件下，通過3次平行試驗測定得到大草烏總黃酮含量為1.457%。

2.4 大草烏黃酮對超氧陰離子自由基的清除作用

通過測定，大草烏總黃酮對超氧陰離子自由基有明顯的清除作用，清除率達到34.49%。說明大草烏總黃酮具有一定的抗氧化作用。由此可見，大草烏具有較高的藥用價值。

3 小結(jié)與討論

采用不同體積分數(shù)乙醇對大草烏總黃酮進行提取，大草烏中的總黃酮一部分為脂溶性，部分為水溶性，這與羅晶[10]對紅景天分析的結(jié)果一致。本試驗結(jié)果中測定的大草烏總黃酮含量為1.457%，與畢和平等[11]分析的穿心蓮結(jié)果比較，大草烏中總黃酮含量比穿心蓮的高，與劉偉玲[12]分析的刺五加葉中總黃酮的結(jié)果比較，大草烏中總黃酮含量則比刺五加葉中的低。說明不同藥用植物中總黃酮含量不同。

本試驗結(jié)果表明，以石油醚脫脂、乙醇回流可提取野生大草烏中總黃酮，提取的最佳條件為乙醇體積分數(shù)70%，回流提取時間3 h，此條件下提取的野生大草烏中總黃酮含量最高，達到1.457%。大草烏總黃酮對超氧陰離子自由基有明顯的清除作用，清除率為34.49%，說明大草烏總黃酮具有一定的抗氧化作用，且具有較高的藥用價值。

參考文獻：

[1] 昆明軍區(qū)勤部衛(wèi)生部.云南中草藥選[M].天津：天津人民出版社，1970.

[2] 劉玉芬，夏海濤，楊樹平.紫外分光光度法測定劍麻花中總黃酮的含量[J].食品科學(xué)，2005，26（9）：418-419.

[3] 李 靜，王成永，張婷婷，等.木瓜中總黃酮成分的提取和含量測定[J]. 中醫(yī)藥臨床雜志，2008，20（6）：617-619.

[4] 梁新紅，趙功玲，趙瑞香.分光光度法測定仙人掌酒中總黃酮含量[J].中國釀造，2007（6）：67-69.

[5] 苗 方，侯剛健，安 蕓，等.分光光度法對銀杏茶中總黃酮的含量測定[J].醫(yī)學(xué)理論與實踐，2009，22（3）：359-360.

[6] 朱 紅，鈕福祥，張愛君，等.甘薯葉中黃酮類化合物提取工藝研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006（5）：154-156.

[7] 鄭津輝，王 威，黃 輝.苦參提取液中黃酮類化合物的抑菌作用[J].武漢大學(xué)學(xué)報（理學(xué)版），2008，54（4）：439-442.

[8] 唐 敏，劉 耀，王 渝，等.金銀花總黃酮粗提物體外抑菌作用研究[J].中國藥房，2008，19（30）：2321-2323.

[9] 董 捷，張紅城，秦 健，等.十種蜂花粉醇提物中總多酚和總黃酮含量測定[J].食品科學(xué)，2008，29（12）：246-249.

[10] 羅 晶.薔薇紅景天總黃酮的提取及分析[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（35）：15546-15547.

[11] 畢和平，韓長日，廖家旺，等.穿心蓮中總黃酮含量的測定[J]. 光譜實驗室，2006，23（2）：356-359.

[12] 劉偉玲.刺五加葉中的主要活性成分分析[J].中醫(yī)藥導(dǎo)報，2009，15（7）：87-88.endprint