β—紫羅蘭酮與β—乳球蛋白相互作用的光譜法研究

馬保亮 魏良淑 劉桂玲 盧禮萍

摘要：在pH=7.0，t=37℃條件下，采用熒光光譜和紫外可見-吸收光譜研究了β-紫羅蘭酮與β-乳球蛋白的相互作用。研究的結果表明：這種相互作用使β-乳球蛋白發(fā)生內(nèi)源熒光猝滅，其機制為靜態(tài)猝滅。通過計算得到了兩者的結合常數(shù)（k=0.605×103L/mol）和結合位點數(shù)（n=1）。

關鍵詞： β-紫羅蘭酮;β-乳球蛋白;熒光猝滅; 同步熒光譜; 紫外可見-吸收光譜;

引言

β-紫羅蘭酮（β-ionone） 是一種芳香族化合物，結構（如圖2）中含有一個芳香苯環(huán)，具有疏水性。它廣泛存在于天然食物中，比如水果、蔬菜、谷物及牛奶中，在醫(yī)藥工業(yè)中還可以用于合成維生素A和β-胡蘿卜素[4，5]，這與人們的生活息息相關。β-紫羅蘭酮是一個單體，卻表現(xiàn)出較強的抗癌作用[6，7]。研究蛋白質(zhì)與β-紫羅蘭酮的相互作用，可以為了解β-紫羅蘭酮的生物活性機制提供重要線索。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

F-4600型熒光分光光度計（日本日立公司）;UV-1800型紫外可見分光光度計（上海Shimadzu公司）;UB-10標準型PH計（上海華耀貿(mào)易公司 ）;FA1604B型電子分析天平（北京賽多利斯有限公司）;

β-乳球蛋白和β-紫羅蘭酮購買于美國Sigma公司;磷酸鈉緩沖液所用試劑為國內(nèi)生化公司購置的分析純;所用水為超純?nèi)ルx子水。

1.2 實驗方法

準確稱量β-紫羅蘭酮并配置成濃度為1mmol/L的溶液，準確稱量β-乳球蛋白并配置成5 mg/ml的溶液，其中使用的緩沖液均為磷酸鈉緩沖液（pH=7.0），置于4 的冰箱中保存。

在10 ml比色管中依次加入pH=7.0的緩沖溶液、1.0mlβ-乳球蛋白溶液和一定量的β-紫羅蘭酮溶液，然后在27 和37 水浴鍋中充分培養(yǎng)30分鐘后開始測試熒光光譜。

熒光光譜測量，激發(fā)光狹縫和發(fā)射光狹縫均為2.5nm。內(nèi)源發(fā)射熒光是以280nm作為激發(fā)光波長，記錄300nm-400nm范圍的發(fā)射光譜;同步熒光是固定激發(fā)波長與發(fā)射波長的間距 分別為15nm和60nm， 記錄240-320nmm范圍的熒光光譜。紫外可見-吸收光譜測量范圍為200nm到340nm 。

2 實驗結果與分析

2.1 β-紫羅蘭酮對β-乳球蛋白的猝滅反應

β-LG蛋白分子中含有色氨酸和酪氨酸等氨基酸，具有較強的內(nèi)源熒光。固定β-LG溶液濃度為0.05mg/ml，在其中加入不同濃度的β-紫羅蘭酮，結果發(fā)現(xiàn)，β-LG的熒光峰隨著β-紫羅蘭酮濃度的增加而規(guī)律性降低，同時β-乳球蛋白的最大發(fā)射峰位發(fā)生5nm左右的紅移，如圖3所示，表明β-LG蛋白分子的構象發(fā)生了一定的改變。

對于靜態(tài)猝滅，結合常數(shù)和結合位點數(shù)可由結合常數(shù)表達式（2）推導求出[10 ]：

（2）

2.4β-乳球蛋白與β-紫羅蘭酮之間的能量轉移效率和結合距離

根據(jù)F?rster 非輻射能量轉移理論[11]，可以求出小分子與蛋白質(zhì)發(fā)光基團之間的距離。

能量轉移效率E與供體-受體之間距離r及能量轉移距離臨界R0的關系為：

（6）

R0為能量轉移效率為50%時對應的距離。

（7）

其中 為取向因子，可取受能體與供能體各向隨機分布的平均值 ; 為介質(zhì)的折射指數(shù)，一般取水和有機物折射指數(shù)的平均值1.336， 為供能體的光量子產(chǎn)率，通常取蛋白質(zhì)色氨酸量子產(chǎn)率為0.118，J為供能體的熒光發(fā)射譜與受能體的吸收光譜的重疊積分，可表示為：

（8）

其中 為供能體在波長 處的熒光強度， 為受能體在波長 處的摩爾吸光系數(shù)。摩爾能量轉移效率可以由下式?jīng)Q定：

（9）

式中F0為能量受體不存在時能量供體的熒光發(fā)射強度， F為能量供體和受體濃度為1：1時蛋白質(zhì)的熒光強度 。

圖5為供能體與受能體濃度為1：1時，供能體β-乳球蛋白的熒光發(fā)射光譜（a）與受能體β-紫羅蘭酮的吸收光譜（b）的光譜重疊。將圖中光譜重疊部分分割成極小的矩形面積求和，應用公式（8）算得重疊積分為

代入方程（7）得到臨界距離為 。由式（9）計算得到能量轉移效率為 。根據(jù)公式（6）可以算出β-紫羅蘭酮與β-乳球蛋白熒光殘基間的距離為 。該距離小于7nm，符合能量轉移理論。

2.6 β-紫羅蘭酮對β-乳球蛋白構象的影響

β-紫羅蘭酮加入β-乳球蛋白溶液中，兩者發(fā)生了結合猝滅反應的同時發(fā)射峰位紅移，我們可將通過同步熒光和紫外可見-吸收光譜進一步研究β-紫羅蘭酮對β-乳球蛋白構象的影響。

3 結論

以β-乳球蛋白為基體，通過熒光光譜和紫外可見-吸收光譜研究了β-紫羅蘭酮與蛋白質(zhì)的結合反應。β-紫羅蘭酮進入蛋白質(zhì)分子的疏水腔與疏水氨基酸通過氫鍵和范德華力發(fā)生作用，這與β-紫羅蘭酮分子的疏水性有關。因為兩者的結合作用，一方面，蛋白質(zhì)發(fā)射熒光強度被猝滅，測算結果表明藥物和發(fā)生作用的氨基酸之間作用距離較大，但仍滿足非輻射能量轉移的條件，這也導致了明顯的熒光猝滅;另外，同步熒光光譜中色氨酸熒光發(fā)射峰位紅移，體現(xiàn)了藥物與蛋白質(zhì)的結合位點靠近處于疏水區(qū)的色氨酸殘基，并引起了色氨酸所在環(huán)境疏水性的變化。紫外可見-吸收光譜中190nm附近較強的吸收峰也發(fā)生了顯著紅移，這也進一步證明了β-紫羅蘭酮的加入影響了生色團的疏水環(huán)境。

參考文獻

[1]吳鳳.β-乳球蛋白的分離提純及酶源降膽固醇活性肽的研究[D].安徽農(nóng)業(yè)大學，2009.

[2]李蘭會，孫豐梅，黃娟，等. β-乳球蛋白的熱變性聚集概述[J].中國乳品工業(yè)，2002，30（6）：22-24.

[3] Ma B L， You X ， Lu F J. Inhibitory effects of β-ionone on amyloid fibril formation of β-lactoglobulin， Int. J. Biol. Macromol. 2014，64：162-167.

[4] 孫向榮，劉家仁，孫文廣等.β-紫羅蘭酮誘導SGC-7901細胞凋亡作用[J].衛(wèi)生研究，2007，36（6）：667-670.

[5] 孫青，舒學軍，陳茹冰等.香料紫羅蘭酮的合成研究[J].浙江大學學報（自然科學版），2012，39（1）：56-59.

[6] 劉家仁，李百祥，馬若波等.β-紫羅蘭酮對人乳腺癌細胞抑制作用[J].衛(wèi)生研究，2004，33（2）：151-157.