防治花鰻鱺細(xì)菌性疾病的中西藥篩選

佟延南 王德強(qiáng) 李芳遠(yuǎn) 李忠琴

摘要 [目的] 為花鰻鱺的病害防治提供科學(xué)、有效的理論依據(jù)。[方法] 從花鰻鱺內(nèi)臟組織中分離出3株病原菌（遲鈍愛德華氏菌、嗜水氣單胞菌、威隆氣單胞菌），選擇4種中藥（虎杖、大黃、五倍子、黃連）和3種西藥（氟苯尼考、阿莫西林、強(qiáng)力霉素）采用瓊脂平板稀釋法進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)。[結(jié)果] 4種中藥和3種西藥對花鰻鱺致病菌均有不同程度的抑菌、殺菌效果。五倍子、大黃和氟苯尼考的抑菌能力最強(qiáng)，可作為防治該病的有效藥物。[結(jié)論] 建議在生產(chǎn)實(shí)踐中多使用中草藥或中西藥聯(lián)用。

關(guān)鍵詞 花鰻鱺；病原菌；防治；抑菌試驗(yàn)

中圖分類號 S965.223 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）31-10971-02

Screening Chinese Herbal Medicine and Western Medicine for Controlling Bacterial Diseases of Anguilla marmorata

TONG Yannan， WANG Deqiang*， LI Fangyuan et al

（Hainan Academy of Ocean and Fisheries Sciences， Haikou，Hainan 570100）

Abstract [Objective] The research aimed to provide scientific and effective theoretical basis for controlling the diseases of Anguilla marmorata. [Method] Three strains of pathogenic bacteria （including Edwardsiella tarda， Aeromonas hydrophila and Aeromonas veronii）were isolated from the internal tissues of Anguilla marmorata. Four kinds of Chinese herbal medicine （Fallopia japonica， Rheum officinale， Rhus chinensis and Coptis chinensis） and three kinds of western medicine （florfenicol， amoxicillin and doxycycline） were selected to make the antibacterial test in vitro by using agar plate dilution method. [Result] Four kinds of Chinese herbal medicine and three kinds of western medicine had antibacterial effects on pathogenic bacteria of A. marmorata. Rhus chinensis Mill.，Rheum palmatum Linn.and florfenicol had the highest antibacterial effects， so they could be used as the effective drugs against these diseases. [Conclusion] It was suggested that more Chinese herbal medicine and combined application of Chinese herbal medicine and western medicine should used in the production.

Key words Anguilla marmorata； Pathogenic bacteria； Prevention and control；Antibacterial test

花鰻鱺（Anguilla marmorata）為脊索動物門、脊椎動物亞門、硬骨魚綱、輻鰭亞綱、鰻鱺總目、鰻鱺目、鰻鱺科、鰻鱺屬的一種，又稱鱸鰻，是世界上鰻鱺屬中分布最廣泛的一種^[1]，北至韓國濟(jì)州島、東至小笠原群島、南至南太平洋的馬克薩斯群島、西至非洲東海岸的納塔爾均有分布；在我國自錢塘江至海南省各江河水系中都有分布。

花鰻鱺因其市場價格是其他鰻鱺品種的3～5倍，備受養(yǎng)殖者的青睞，盲目的集約化養(yǎng)殖和養(yǎng)殖環(huán)境的不斷惡化，導(dǎo)致近幾年花鰻鱺養(yǎng)殖病害頻繁發(fā)生，經(jīng)濟(jì)損失慘重。以往關(guān)于花鰻鱺的研究集中在其分類、地理分布、生活習(xí)性、資源調(diào)查等方面^[2-6]，而在花鰻鱺病害防治藥物的研究上極少。筆者以自主分離的花鰻鱺致病菌為研究基礎(chǔ)，選擇4種中藥和3種西藥采用瓊脂平板稀釋法，針對分離的3株花鰻鱺致病菌進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)，以期為養(yǎng)殖戶提供科學(xué)、有效的病害防治理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株

患病鰻鱺采至海南省?？谑写笾缕禄狑~養(yǎng)殖場，從其內(nèi)臟（肝臟、腎臟、脾臟等）器官分離、純化到3株病原菌，由廈門市集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院協(xié)助，通過生理生化和基因鑒定，3株病原菌分別確定為遲鈍愛德華氏菌（Sh1）、嗜水氣單胞菌（L2b）、威隆氣單胞菌（L2s）。

1.2 試驗(yàn)藥材

中藥：虎杖（Rhizoma polygoni Cuspidati，簡稱 RPC）；大黃（Rheum palmatum Linn.，簡稱RPL）； 五倍子（Rhus chinensis Mill.，簡稱RCM）；黃連（Coptis chinensis Franch，簡稱 CCF）。

西藥：氟苯尼考（Florfenicol）、 阿莫西林（Amoxicillin）、強(qiáng)力霉素（Doxycycline hyclate tablets）。

1.3 中藥加工

首先，用中藥粉碎機(jī)粉碎至 100 目左右，然后放入超微粉碎機(jī)進(jìn)一步粉碎，收集超微藥粉備用。在掃描電子顯微鏡下觀察，90%以上的顆粒粒徑大小為 5～10 μm。

1.4 菌懸液的制備

將保種的菌液接種于瓊脂平板上，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 20～24 h；挑取單個菌落劃線至新鮮斜面上，28 ℃下培養(yǎng)20～24 h 后，用無菌生理鹽水將菌體沖洗下來，使用濁度儀將菌液濃度稀釋至 107 CFU/ml，即可作為藥敏試驗(yàn)接種的菌懸液。

1.5 中草藥抑菌試驗(yàn)

采用瓊脂稀釋法^[7]，以中草藥為溶質(zhì)，以營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基為溶劑，配制出2倍濃度梯度的藥敏培養(yǎng)基（除五倍子的稀釋梯度為0.50、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25、0.015 625和0.007 812 5 mg/L；其他3種中草藥的稀釋梯度為64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25和0.125 mg/L）。藥敏培養(yǎng)基均經(jīng)過高壓滅菌后倒平板，取已調(diào)好濃度的菌液2 μl接種在含藥平板上，每個藥物梯度做3組平行試驗(yàn)。將接種好的平板放置28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24和48 h。

1.6 西藥抑菌試驗(yàn)

首先用無菌水配置1 mg/ml西藥母液，然后以高壓滅菌后的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基為溶劑，采用二倍稀釋法配制不同濃度梯度的藥敏培養(yǎng)基（濃度梯度為25.6、12.8、6.4、3.2、1.6、0.8、0.4、0.2、0.1和0.05 μg/L）。取已配制的菌液2 μl接種在含藥平板上，每個藥物梯度做3組平行試驗(yàn)。將接種好的平板放置28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24和48 h。

1.7 結(jié)果觀察

以 24 h 無菌落形成的最低濃度為中藥對該菌株的最低抑菌濃度（MIC），以 48 h藥板上無菌落形成的最低濃度為中藥對該菌株的最低殺菌濃度（MBC）。只有2個平行組的MIC值或MBC值一致時，才能界定為抑菌（殺菌）濃度，否則需要進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 中草藥對3株病原菌的抑制作用

比較了 4 種中藥對養(yǎng)殖花鰻鱺 3株病原菌的最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）。由表1可知，五倍子、大黃、黃連、虎杖對 3株致病菌均具有一定的抑制效果，且MIC值和MBC值相等或呈雙倍關(guān)系。其中，4種中草藥對Sh1菌株的MIC值：五倍子<大黃<黃連<虎杖；4種中草藥對Sh1菌株的MBC值：五倍子<大黃<黃連<虎杖，五倍子和黃連的MIC值和MBC值相同，大黃和虎杖的MBC值是MIC值的2倍。4種中草藥對L2b菌株的MIC值：五倍子<大黃<黃連<虎杖；4種中草藥對Sh1菌株的MBC值：五倍子<大黃<黃連<虎杖，五倍子、黃連和虎杖的MIC值和MBC值相同，大黃的MBC值是MIC值的2倍。4種中草藥對L2s菌株的MIC值：五倍子<大黃<黃連<虎杖；4種中草藥對Sh1菌株的MBC值：五倍子<大黃<黃連<虎杖，五倍子、大黃和黃連的MIC值和MBC值相同，而虎杖的MBC值是MIC值的2倍。

2.2 西藥對3株病原菌的抑制作用

比較了3種西藥對養(yǎng)殖花鰻鱺 3株病原菌的最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）。由表2可知，氟苯尼考、阿莫西林和強(qiáng)力霉素對3株致病菌均有良好的抗菌活性，其中強(qiáng)力霉素對Sh1菌株的MIC值最小，達(dá)到0.2 μg/ml；其次是氟苯尼考、阿莫西林，對Sh1菌株的MIC值分別達(dá)到0.8和6.4 μg/ml；阿莫西林和強(qiáng)力霉素的MBC值與MIC值相同，氟苯尼考的MBC值為25.6 μg/ml。氟苯尼考對L2b菌株的MIC值最小，小于0.05 μg/ml；其次是強(qiáng)力霉素、阿莫西林，對L2b菌株的MIC值分別為0.2和6.4 μg/ml；阿莫西林和強(qiáng)力霉素的MBC值與MIC值相同，氟苯尼考的MBC值與MIC值均小于0.05 μg/ml。氟苯尼考對L2s菌株的MIC值最小，小于0.05 μg/ml，其次是強(qiáng)力霉素、阿莫西林，對L2b菌株的MIC值分別為0.8和3.2 μg/ml；阿莫西林和強(qiáng)力霉素的MBC值與MIC值相同，氟苯尼考的MBC值與MIC值均小于0.05 μg/ml。

3 討論與結(jié)論

3.1 中藥對3株花鰻鱺病原菌的抑制作用

中草藥具有天然性、營養(yǎng)性、毒副作用小、無抗藥性等優(yōu)點(diǎn)^[8-9]，其在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的主要作用包括：防治疾病、增強(qiáng)免疫力；促進(jìn)生長，提高飼料利用率；提高存活率；減少應(yīng)激作用，增加動物的耐受力等作用^[10-12]。筆者研究了4種中草藥對3株花鰻鱺致病菌的MIC值和MBC值，其平均MIC值大小依次為虎杖>黃連>大黃>五倍子，平均MBC值大小依次為虎杖>黃連>大黃>五倍子。不同中草藥對同一菌株的抑制效果不同，其原因可能是不同中藥草其抑菌成分不同，如五倍子的主要抑菌成分為丙酮提取物^[13]；而黃連的主要抑菌成分為小檗堿^[14]。另外，各試驗(yàn)組中有些菌株的MIC值和MBC值略有不同，說明中草藥作用于該菌株時，其抑菌濃度和殺菌濃度不同，為今后生產(chǎn)與應(yīng)用提供理論依據(jù)。

3.2 西藥對3株花鰻鱺病原菌的抑制作用

臨床實(shí)踐表明，抗菌西藥對各種細(xì)菌性疾病均有良好的療效。該研究中3種抗菌西藥對3株花鰻鱺病原菌均具有較好的殺菌、抑菌效果，其平均MIC值大小依次為阿莫西林>強(qiáng)力霉素>氟苯尼考，平均MBC值大小依次為阿莫西林>強(qiáng)力霉素>氟苯尼考。但是，同種抗菌藥對不同菌株抑菌效果有所差異，氟苯尼考對Sh1抑制效果最差（MIC值為0.8 μg/ml），強(qiáng)力霉素對L2s抑制效果最差（MIC值為0.8 μg/ml），而阿莫西林則對Sh1和L2b抑制效果最差（MIC值為6.4 μg/ml）。

該研究中4種中草藥和3種西藥對花鰻鱺致病菌均有不同程度的抑菌、殺菌效果，但因抗生素經(jīng)常導(dǎo)致耐藥菌株的產(chǎn)生和水產(chǎn)品藥物殘留等問題^[15]，建議在生產(chǎn)實(shí)踐中多使用中草藥或中西藥聯(lián)用，而中西藥聯(lián)用配伍比例有待下一步研究。

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