野韭菜花器官脫分化影響因子研究

王茜 龍驪豐 韋鵬霄 岑秀芬 萬正林 龍明華

摘要 [目的] 研究影響野韭菜花器官脫分化的誘導(dǎo)因子。[方法]將野韭菜花器官進(jìn)行離體培養(yǎng)，探討培養(yǎng)基種類、外源激素種類和濃度及配比、花器官不同發(fā)育時期及不同部位對愈傷組織誘導(dǎo)的影響。[結(jié)果]MS基本培養(yǎng)基最適合花蕾愈傷組織的誘導(dǎo)；NAA比其他生長素更有利于提高花蕾的岀愈率；花苞未開狀態(tài)的花蕾愈傷組織誘導(dǎo)率最高；愈傷組織發(fā)生具有明顯的部位效應(yīng)，最好是花盤，其次是花蕾，較差是花柄，而花莖無愈傷組織發(fā)生。[結(jié)論] 為建立野韭菜組織培養(yǎng)快繁體系奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 野韭菜；愈傷組織誘導(dǎo)；花器官

中圖分類號 S633.3 文獻(xiàn)標(biāo)識碼

A 文章編號 0517-6611（2014）31-10861-03

Research on Factors of the Dedifferentiation of Floral Organ in Allium hookeri Thwaites

WANG Xi1，LONG Lifeng2， WEI Pengxiao1， LONG Minghua1* et al （1.College of Agriculture， Guangxi University， Nanning， Guangxi 530004；2.College of Science and Technology， Guangxi University Xingjian College of Science and Liberal Arts， Nanning， Guangxi 530005）

Abstract [Objective] The aim was to study factors of the differentiation of floral organ in Allium hookeri Thwaites.[Method]Using flower organ of Allium hookeri Thwaites as explants， the influence of different factors， including medium variety， the concentration and ingredient of exogenous hormones and the different growth stages of flower organ were investigated. [Result]The results revealed that MS basic medium was optimum for callus induction. Among those auxins， NAA was the best to improve the induction rate of flower buds， and the callus induction showed the highest rate in the unopened flower buds. The study also demonstrated that the callus induction was obvious distinguishing in different flower positions. The callus of flower disc was better than bud， while pedicel showed the lower rate in callus induction and the floral axis had no dedifferentiation.[Conclusion]The study laid technology foundation for establishing tissue culture rapid propagation system of Allium hookeri Thwaites.

Key words Allium hookeri Thwaites； Callus induction； Flower organ

野韭菜（Allium hookeri Thwaites）為百合科蔥屬多年生草本植物，原稱為寬葉韭，又稱為大葉韭、觀音菜、巖蔥等，我國各地均有分布^[1]。野韭菜和普通韭菜很相似，多以其嫩葉和成長葉食用。其葉片較寬，纖維含量稍多，具有蔥香味，富含碳水化合物、維生素C及硫、鐵、磷等礦物質(zhì)元素，尤其含豐富的胡蘿卜素和纖維素，還含有辛香的揮發(fā)性物質(zhì)——硫化丙烯，有增進(jìn)食欲和殺菌的作用^[2]。此外，野韭菜還有溫中行氣、散血解毒、健胃整腸等功效^[1]。由于野韭菜的保健功能和人們崇尚回歸自然的消費理念，目前市場上對包括野韭菜在內(nèi)的野生蔬菜的需求與日俱增，供不應(yīng)求。但野韭菜只開花而不能結(jié)籽，其繁殖方式以分株繁殖為主，繁殖周期長，繁殖率低，極大影響了野韭菜的大面積推廣種植，因此研究野韭菜的組培快繁技術(shù)顯得尤為重要。目前有關(guān)野韭菜的組織培養(yǎng)方面的研究較少，筆者研究了影響野韭菜花器官脫分化的誘導(dǎo)因子，旨在為建立野韭菜組織培養(yǎng)快繁體系奠定技術(shù)基礎(chǔ)，也為野韭菜種質(zhì)資源的保存和開發(fā)利用探索生物技術(shù)上的方法和途徑。

1 材料與方法

1.1 材料 以采自廣西金秀縣圣堂山上的野韭菜花器官（花莖、花盤、花柄、花蕾）為試驗材料。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基配制。以MS、Miller、White培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，并添加不同的植物生長調(diào)節(jié)劑，附加蔗糖30 g/L、瓊脂6 g/L，pH調(diào)至5.8。

1.2.2 外植體滅菌。于晴天上午采取健壯且無病蟲害的花器官。按照花苞開放狀態(tài)（未開、半開、全開），將花器官材料分為3組。分別將3組材料置于洗潔精溶液中，用軟毛刷輕刷表面塵埃后用清水沖洗30 min；在超凈工作臺上將洗凈的材料置于無菌燒杯中，用75%乙醇精漂洗30 s；再用0.1%升汞浸泡滅菌10 min，并不斷晃動；滅菌完畢用無菌水清洗5次，備用。

1.2.3 外植體接種。將滅過菌的花蕾、花柄、花盤、距花盤5 cm內(nèi)的花莖等外植體分別接入添加不同激素的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。每組處理接30瓶，每瓶接種3個外植體，設(shè)3次重復(fù)。

1.2.4 培養(yǎng)條件。將接種好的試驗材料置于培養(yǎng)室中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為（25±2）℃，暗培養(yǎng)15 d后轉(zhuǎn)入光下培養(yǎng)，光照強(qiáng)度1 000～1 500 lx，光照時間12 h/d。

1.3 數(shù)據(jù)分析 接種后定期觀察各種外植體、各試驗處理的愈傷組織發(fā)生情況，觀察愈傷組織的質(zhì)量、出愈時間并統(tǒng)計岀愈率。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基種類對野韭菜花苞未開花蕾愈傷組織誘導(dǎo)的影響

由于不同基本培養(yǎng)基所含的礦物質(zhì)種類和配比差異較大，因此對野韭菜花苞未開花蕾愈傷組織誘導(dǎo)的效果也存在差異。從表1可以看出，在MS、Miller、White 3種基本培養(yǎng)基中加入相同的激素組合，MS培養(yǎng)基對花苞未開花蕾的愈傷組織誘導(dǎo)率最高，愈傷組織的質(zhì)量也最好。這可能是由于MS基本培養(yǎng)基的礦物質(zhì)種類及比例較適合野韭菜花蕾愈傷組織的發(fā)生?；ɡ俚挠鷤M織誘導(dǎo)率由高到低的基本培養(yǎng)基順序為MS>Miller>White。各個處理的差異均達(dá)極顯著水平。這表明選擇合適的基本培養(yǎng)基可以提高愈傷組織的誘導(dǎo)率，MS基本培養(yǎng)基最適合野韭菜花苞未開花蕾愈傷組織的誘導(dǎo)。

2.2 不同種類生長素與6BA組合對野韭菜花苞未開花蕾愈傷組織誘導(dǎo)的影響 生長素是植物組織培養(yǎng)中不可缺少的物質(zhì)之一，不同生長素對植物愈傷組織的形成影響不同。從表2可以看出，在相同濃度的NAA、IAA、IBA、2，4D與同一濃度的6BA組合處理中，以NAA與6BA組合的處理對野韭菜花苞未開花蕾愈傷組織誘導(dǎo)率最高，其次是2，4D，再次是IBA，最低是IAA，4種生長素處理之間的差異達(dá)極顯著水平。這表明選擇合適的生長素可以提高花苞未開花蕾愈傷組織的誘導(dǎo)率，在4種生長素中NAA最適合野韭菜花苞未開花蕾愈組的誘導(dǎo)。

3 討論

3.1 基本培養(yǎng)基的影響 器官發(fā)生是生物學(xué)中的基本問題之一，受到各種內(nèi)外因子的影響及調(diào)控。培養(yǎng)基能為植物的生長提供營養(yǎng)，是組織培養(yǎng)過程中必不可少的物質(zhì)基礎(chǔ)。不同植物的遺傳特性、生物學(xué)特性、生態(tài)學(xué)特性不同，這使得植物對各種營養(yǎng)元素的吸收量不同，最適培養(yǎng)基的成分也存在差異。饒月輝等^[4]通過試驗比較了MS、WH、LS、N6和SH 5種培養(yǎng)基對韭菜栽培品種莖尖培養(yǎng)的影響，結(jié)果表明，MS是韭菜栽培品種莖尖組織培養(yǎng)最適基本培養(yǎng)基。李勇等^[5]、王明耀等^[6]、王桂英^[7]分別通過花托、花器官、根尖在MS培養(yǎng)基上添加不同的激素成功地誘導(dǎo)出韭菜栽培品種的愈傷組織，只是未做不同培養(yǎng)基的對比試驗。結(jié)果表明，在MS、Miller、White 3種培養(yǎng)基中，MS培養(yǎng)基對野韭菜花蕾愈傷組織誘導(dǎo)的效果最好。原因可能是MS培養(yǎng)基屬于富集元素平衡培養(yǎng)基，大量元素和微量元素的含量齊全且豐富，具有較好的誘導(dǎo)性能；而Miller和White分別是中等無機(jī)鹽培養(yǎng)基和低無機(jī)鹽培養(yǎng)基^[8-9]，它們的組成或含量并未達(dá)到誘導(dǎo)野韭菜花蕾出愈的最佳要求。

3.2 植物生長調(diào)節(jié)劑的影響

在組織培養(yǎng)過程中添加一定種類和濃度的生長調(diào)節(jié)劑是植物脫分化和再分化的重要手段^[10]。植物生長內(nèi)源調(diào)節(jié)物質(zhì)對植物組織和細(xì)胞的增殖、分化起著關(guān)鍵作用；培養(yǎng)基中的外源植物調(diào)節(jié)劑主要是通過對細(xì)胞的基因表達(dá)與活性調(diào)控影響細(xì)胞的脫分化，其適宜的種類和配比水平，反映了植物組織和器官的內(nèi)源激素水平的差異與其在脫分化過程中對這些物質(zhì)的要求^[11-12]。植物生長調(diào)節(jié)劑在一定的范圍內(nèi)能促進(jìn)生長，但過高或過低都會影響其生長^[13]。該試驗結(jié)果表明，在NAA 0～1.5 mg/L時，當(dāng)濃度為1.0 mg/L時愈組誘導(dǎo)率最高，為NAA的最佳濃度。王明耀等^[6]通過試驗證明花器官的岀愈率主要與生長素和細(xì)胞分裂素的種類和配比有關(guān)，在其處理中添加6BA 1.0 mg/L+ NAA 0.5 mg/L，6BA 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+KT 1.0 mg/L 2組激素組合的MS培養(yǎng)基對韭菜栽培品種花蕾愈傷組織誘導(dǎo)效果明顯，與該研究較一致。該研究進(jìn)一步進(jìn)行了生長素種類及濃度的篩選試驗，使試驗進(jìn)一步細(xì)化，發(fā)現(xiàn)在愈傷組織誘導(dǎo)階段，2，4D的效果優(yōu)于CPPU，更優(yōu)于KT。

3.3 植物生理狀態(tài)的影響 已分化的植物細(xì)胞具有全能性。一般而言，細(xì)胞全能性的高低與細(xì)胞的分化程度有關(guān)，分化程度越高，細(xì)胞全能性越低，全能性的表達(dá)就越困難。對于野韭菜而言，花器官是其生長發(fā)育最旺盛的部位之一。在形態(tài)發(fā)生的研究中，將外源激素與物種的遺傳性及器官和組織的生理狀態(tài)聯(lián)系起來的工作很有限，且外源激素對器官發(fā)生的作用機(jī)理也不十分清楚^[14]。因此建立一個較好的試驗材料體系是必須且重要的。

該研究證明野韭菜花苞開放狀態(tài)是影響花器官岀愈率的主要影響因子?；ò撮_花器官是培養(yǎng)野韭菜植株再生的優(yōu)良外植體，其中花盤岀愈率最高，為100%?；ㄇo在所研究的花苞各種開放狀態(tài)下及各種激素組合下無分化能力，不推薦其作為野韭菜快繁的外植體材料。說明植物的遺傳性及生理狀態(tài)在形態(tài)發(fā)生過程中所起的作用可能比激素本身更加關(guān)鍵。此結(jié)論與王明耀^[6]、郝建平等^[15]的試驗結(jié)果一致。因此，通過脫分化途徑來進(jìn)行野韭菜組培快繁時，應(yīng)注意在外植體材料本身的遺傳性及生理狀態(tài)方面進(jìn)行篩選。

4 結(jié)論

綜上所述，MS培養(yǎng)基最適合野韭菜花蕾愈傷組織誘導(dǎo)；2種激素組合中以6BA 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L對花苞未開花蕾愈組誘導(dǎo)效果最好；3種激素組合中以2，4D、6BA與NAA的組合對野韭菜花器官愈傷組織誘導(dǎo)效果最好；岀愈率高低按照花器官部位排序為花盤>花蕾>花柄>花莖；岀愈率高低按照花器官發(fā)育時期即花苞開放狀態(tài)排序為未開狀態(tài)>半開狀態(tài)>全開狀態(tài)。

對野韭菜花器官脫分化得到的愈傷組織進(jìn)行繼代增殖，再分化獲取完整植株等后續(xù)試驗研究正在進(jìn)行之中。

參考文獻(xiàn)

[1]

劉朝安，曾文丹，武鵬，等.野韭菜的植物學(xué)特性及其栽培技術(shù)[J].北方園藝，2013（3）：211.

[2] 屈二軍，張現(xiàn)青，趙禎，等.韭菜愈傷組織誘導(dǎo)條件優(yōu)化的研究[J].種子世界，2008（6）：24-25.

[3] 侯勇，馬國瑞，夏中梅，等.CPPU研究進(jìn)展[J].植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報，1999，5（2）：106-114.

[4] 饒月輝，游黨呈，周仙祥.韭菜組織培養(yǎng)及快速繁殖技術(shù)研究[J].江西農(nóng)業(yè)學(xué)報，2007，19（5）：64-65.

[5] 李勇，楊樺，龍蔚，等. 韭菜組織培養(yǎng)及快速繁殖技術(shù)研究[J].江西農(nóng)業(yè)學(xué)報，2006，18（4）：37-38.

[6] 王明耀，王桂英，田金玉，等.韭菜花器官的組織培養(yǎng)[J].河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2005，28（2）：40-43.

[7] 王桂英.韭菜根尖培養(yǎng)及植株再生[J].北方園藝，2007（12）：199-200.

[8] 楊秀平，劉莉麗.植物組織培養(yǎng)常用基本培養(yǎng)基的數(shù)量分析[J].西北林學(xué)院學(xué)報，2010，25（1）：97-100.

[9] 李好.植物組織培養(yǎng)簡介[J].考試周刊，2011（26）：200-201.

[10] 徐士清，楊世湖，倪丹，等.非洲菊試管苗葉片的組織快繁[J].園藝學(xué)報，2002，29（5）：493-494.

[11] CHRISTIN H，VENDRING J C，CNCKLEN H V.The accumulation and met abolism on plan growth regulators during organogenesis in cultues of thin cellayex of Niotiana tabaccum[J].Physiol Plant，1991，83：578-584.

[12] CHEVRE A M.In vitro vegetative multiplication of chestnut[J].J of Hort Sic，1983，58（1）：23-29.

[13] 譚文澄，戴策剛.觀賞植物組織培養(yǎng)技術(shù)[M].北京：中國林業(yè)出版社，1999：118-119.

[14] 劉滌，遲靜芬，劉桂蕓.煙草愈傷組織器官發(fā)生過程中外源激素的作用[J].植物生理學(xué)報，1986，12（1）：104-108.

[15] 郝建平，周小梅，李紹清.韭菜花序培養(yǎng)與植株再生[J].山西大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，1995，18（1）：59-62.