酶基抗生物粘泥復合膜的制備及性能

姜艷軍，吳欣蕊，馮 凱，周麗亞，高 靜

（河北工業(yè)大學 化工學院，天津 300130）

生物粘泥（slime）是由微生物及其產(chǎn)生的胞外聚合物與其它有機和無機雜質(zhì)混在一起，粘著在物體表面的粘滯性物質(zhì)，廣泛存在于循環(huán)冷卻水系統(tǒng)的管道、冷卻塔、船體及水下作業(yè)的設備壁上.其危害是導致設備嚴重腐蝕和結垢，降低換熱效果、縮短設備使用壽命等，嚴重影響生產(chǎn)裝置的正常運行，因此，對生物粘泥控制、剝離清洗十分必要[1].目前，控制生物粘泥的方法很多，可分為物理法、化學法和生物法[2].其中傳統(tǒng)的控制方法是化學法，即向水系統(tǒng)中投加殺生劑或殺菌劑，通過直接殺滅微生物來減緩生物粘泥的生長[3].而殺生劑一般為化學藥劑，會造成環(huán)境水體的污染，不符合現(xiàn)在倡導的綠色環(huán)保的要求.

采用生物法降解生物粘泥越來越受到人們的關注.酶是一種特殊的蛋白質(zhì)，在處理過程中不會對環(huán)境造成污染，且能夠有效的控制生物粘泥的生長.盡管國內(nèi)已有用酶處理生物粘泥的報道，但都是將酶直接溶于水系統(tǒng)中以降解生物粘泥，這種方法酶易失活且不利于重復使用.在國外，近年來基于酶的抗生物粘泥涂層技術得到了重視和良好的發(fā)展[4-6].Hamade等人[7]利用溶菌酶降解細胞壁從而殺滅微生物的功能制備了含5%溶菌酶的復合涂層，并取得專利.蛋白酶、纖維素酶、淀粉酶等具有降解生物粘泥的酶類也用于涂層制備，可很好的降解生物粘泥，達到抗污效果[8-10].基于酶的抗生物粘泥涂層的一個關鍵問題是酶的活性和穩(wěn)定性.采用固定化技術為酶創(chuàng)造適宜的微環(huán)境是保持酶的活性和提高穩(wěn)定性的有效手段.Dordick等人[11]利用二氧化硅固定蛋白水解酶制備具有生物催化活性的抗污涂層，獲得了較好的抗蛋白吸附性能.但這種抗污涂層在酶催化活性和酶活穩(wěn)定性方面有待提高.

納米材料其相對于傳統(tǒng)的酶載體材料而言，具有良好的生物相容性、較大的比表面積、較小的擴散限制和高曲率等優(yōu)點，這使得它在該領域有很大的應用空間[12-13].Jia等人[14]發(fā)現(xiàn)，納米材料顯著的尺寸效應可以提高酶與底物的碰撞速率，從而有效提高固定化酶的催化效率.同時，Vertegel和Kim[15-16]均證明，納米顆粒的尺寸對固定化酶的結構有很大影響，有利于酶活的保持.氧化石墨烯和碳納米管是新型的納米材料.氧化石墨烯是石墨烯的氧化物，其表面具有豐富的氧基官能團[17-19].而碳納米管是由石墨片層卷成的無縫、中空管體.氧化石墨烯和碳納米管均具有超大的比表面積、良好的介導性質(zhì)，此外，由于氧化石墨烯表面大量官能團的存在，其碳骨架在理論上存在無限修飾和官能化的可能[20-21].這兩種納米材料在固定化酶領域都有良好的應用前景.本研究以物理吸附法固定胰蛋白酶，載體與蛋白酶之間以弱相互作用相結合，制備方法簡便，固定條件溫和.Karajanagi等人[22]研究發(fā)現(xiàn)，以碳納米管為載體固定糜蛋白酶時，酶分子的二級結構很穩(wěn)定， 螺旋和 折疊的數(shù)量均沒有明顯的增減.Rege等人[23]對比研究了聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）、聚苯乙烯（PS）和聚乳酸（PLA）三種聚合材料分別與固定化酶結合制備復合膜的催化活性和穩(wěn)定性，結果發(fā)現(xiàn)PMMA復合膜的酶催化活性要遠高于其它材料制備的復合膜.

本研究選用多壁碳納米管和可大量修飾和官能化的氧化石墨烯2種材料為載體固定胰蛋白酶，并將固定化酶與高分子聚合材料聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）相結合，制備具有生物催化活性的酶基抗生物粘泥復合膜，并從多方面對復合膜的穩(wěn)定性、力學性能、抗污性能等進行了評價和研究.

1 實驗材料和方法

1.1 實驗材料

胰蛋白酶、牛血清白蛋白（BSA）由鼎國生物技術有限公司購買；多壁碳納米管（MWNTs）由深圳納米港有限公司生產(chǎn)；氧化石墨烯（GO），由山西煤炭化學研究所生產(chǎn)；聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）由榮昌塑膠原料公司生產(chǎn)；磷酸一氫鈉、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉、三氯乙酸（TCA）、干酪素、考馬斯亮藍 G250、氯化鈉、酵母浸粉、胰蛋白胨、甲苯、丙酮、無水乙醇、甲醇、異丙醇均由天津市江天化工技術有限公司生產(chǎn)；金黃色葡萄球菌（S.aureus）、大腸桿菌（E.coli）由本實驗室自己培養(yǎng)獲得.

1.2 實驗儀器

WDW-02微控電子萬能試驗機，長春新科實驗儀器有限公司；DSA30研究型接觸角測量儀，德國Kruss公司；冷凍高速離心機，SIGMA公司；紫外可見分光光度計Evolution300，Thermo FisherScientific公司；集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限責任公司；光學顯微鏡XSZ-H、電子天平、pH計，上海精密科學儀器有限公司.

1.3 實驗方法

1.3.1 固定化酶的制備

將2mgMWNTs（或GO）載體置于1m L pH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液（PBS）中，超聲波處理15min，使其均勻分散.冷卻至室溫，加入用同樣緩沖溶液配制的酶液，室溫下，搖床200 r/m in吸附2h.10000 r/min下離心20min，棄上清液，加入pH 7.0的PBS緩沖液洗去未被固定的游離酶.再離心，重復上述步驟3次.向得到的固定化酶中加入2m L丙酮溶劑，混合振蕩1m in后離心棄上清，重復3次，使有機相完全置換出固定化酶中的水相后，將固定化酶置于通風處2 h左右，待有機溶劑完全揮發(fā)后，即得到干燥的固定化酶.

1.3.2 固定化酶活性檢測

胰蛋白酶催化水解底物酪蛋白生成不被三氯乙酸沉淀的小分子肽以及氨基酸.在一定濃度范圍內(nèi)，酶的水解濾液在波長275 nm處光吸收的增值與胰蛋白酶的活力單位成正比，測定中以標準酪氨酸溶液的光吸收作對照，根據(jù)活力單位的定義，確定樣品中胰蛋白酶的活性.酶活力單位的定義：25℃，pH 7.0條件下，單位時間內(nèi)生成1 g酪氨酸所需要的酶量為1U.

在25℃下，向制得的固定化酶中加入2m L 1%的酪蛋白溶液，反應5m in，加入2m L 20%的TCA溶液終止反應.8 000 r/m in離心5m in，過濾上清液，在275 nm紫外光下測上清液的吸光度值.

1.3.3 不同有機溶劑對固定化酶活性的影響

分別取2m L甲醇、乙醇、丙酮、異丙醇和甲苯加入到用PBS緩沖液洗好的固定化酶中，振蕩1min，使有機相和水相充分混合，5 000 r/m in下離心5 m in，棄上清，重復上述步驟三次以完全除去固定化酶中的水相，將酶置于通風處2 h，有機溶劑揮發(fā)后即可得到干燥的固定化酶粉.檢測對比其活性.

1.3.4 抗生物粘泥復合膜的制備

分別取10mg胰蛋白酶粉和10mg MWNTs或2mg GO，按上述方法制備固定化酶，得到兩種干燥的固定化酶粉末.另稱取10mg胰蛋白酶粉至試管內(nèi).稱1 g PMMA顆粒，加入到3 g甲苯中，在80℃恒溫磁力攪拌水浴鍋中溶解完全，稍冷卻至室溫后加入制備好的MWNTs-Enzyme，混合均勻，平鋪在玻璃板上，晾干即可.GO-Enzyme-PMMA復合膜和Enzyme-PMMA復合膜的制備方法同上.

1.3.5 抗生物粘泥復合膜活性檢測

將復合膜置于10m L 1%的酪蛋白溶液中，30℃下反應30m in，加入TCA終止反應，離心過濾上清液，在275 nm波長下測吸光度值.

1.3.6 抗蛋白質(zhì)吸附實驗

配制10mg/m L的BSA溶液，將面積為2.5×4 cm2的抗生物粘泥復合膜完全浸沒其中，4℃下冷藏保存.用Bradford法分別測復合膜表面的蛋白質(zhì)吸附量，即將復合膜在蒸餾水中輕蘸3次后，用PBS緩沖液反復淋洗復合膜，以洗下膜表面吸附的蛋白質(zhì).取1m L待測液加入到5m L考馬斯亮藍溶液中，反應5m in，在595 nm波長下測吸光度值.

1.3.7 抗菌實驗

選金黃色葡萄球菌（革蘭氏陽性菌）和大腸桿菌（革蘭氏陰性菌），LB培養(yǎng)基常溫搖床培養(yǎng)12h，使細菌處于對數(shù)期末期.將面積為2×5 cm2的復合膜浸沒于細菌懸濁液中，25℃下?lián)u床150 r/m in培養(yǎng)2 h，取出后將復合膜放入蒸餾水中輕蘸3次，去掉表面未附著的細菌.結晶紫染色液染色，晾干.在膜表面任意位置覆蓋1張網(wǎng)格片，其中每小格的面積為190 m2.用光學顯微鏡油鏡觀察，隨機數(shù)出每1小格內(nèi)細胞個數(shù).在不同位置重復上述步驟10次，得到N1-N10.最后計算出單位面積（1 cm2）復合膜表面附著的細胞總個數(shù)N.

所有實驗數(shù)據(jù)均取3次平行實驗結果的均值.

2 結果與討論

2.1 載體與酶的質(zhì)量比對固定酶活性的影響

不同載體對酶的負載能力不同，首先研究了 MWNTs和GO對胰蛋白酶的負載能力.在固定兩種載體質(zhì)量均為2 mg的情況下，依次加入不同質(zhì)量的胰蛋白酶粉，得到了酶與載體的最佳質(zhì)量比，優(yōu)化了固定化酶的條件.如圖1所示.

載體MWNTs和GO達到吸附飽和時，與酶的質(zhì)量比分別為1∶1和1∶5，繼續(xù)增大酶的加入量，酶活性基本保持不變.在兩種載體達到吸附飽和時，MWNTs固定化酶的比活力為32.1 U/mg蛋白，GO固定化酶的比活力為8.83 U/mg蛋白.可以看出，MWNTs固定化酶的活性要遠大于GO固定化酶，這是因為MWNTs可以增加吸附在其表面的蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，從而有助于更好的保持酶的催化活性[24].

圖1 載體與酶的最佳質(zhì)量比Fig.1 Theoptimal ratio of enzymeand supports

2.2 不同有機溶劑對固定化酶活性的影響

研究了甲醇、乙醇、丙酮、異丙醇和甲苯5種有機溶劑對固定化蛋白酶活性的影響規(guī)律（見表1）.結果表明，與用pH 7.0的PBS緩沖液淋洗固定化酶相比，丙酮可成倍的提高酶活性，乙醇也能夠很好的保持酶活性；相反，甲醇和異丙醇則會造成酶活性的大幅損失，而甲苯會使固定酶活性損失40%左右.這與M ichaela等人的研究結果一致[24].部分有機溶劑能提高蛋白酶活性的原因是溶劑在使酶分子脫水的同時能將酶活變性損失降到最低，且使絕大多數(shù)酶分子處在活化構象上，有利于酶催化反應的進行[25].

2.3 酶基抗生物粘泥復合膜性能評價

2.3.1 酶基抗生物粘泥復合膜的穩(wěn)定性研究

圖2為制備好的復合膜樣品，從左向右依次為GO-Enzyme-PMMA復合膜、MWNTs-Enzyme-PMMA復合膜和不含酶的PMMA膜.

首先對復合膜的保存穩(wěn)定性進行了研究.對照實驗為用胰蛋白酶粉制備的復合膜.將復合膜分別置于25℃和50℃干燥恒溫環(huán)境中保存，每3 d取出1次測其活性，加入酶粉的復合膜在第12 d的時候活性基本降為0，而加入固定化酶的復合膜表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性.在第30 d時，25℃保存的GO-Enzyme-PMMA復合膜酶活性能保持在91.1%，50℃保存的則為89.9%，兩者相差不大，可見GO能對酶起到較好的保護作用.而對于MWNTs-Enzyme-PMMA復合膜而言，因為MWNTs具有良好的介導性質(zhì)和特殊的理化性質(zhì)，能夠較好的保護酶的活性位點[24]，從而大幅降低了酶在高溫條件下的活性損失.而在Dordick等人利用二氧化硅固定酶并制備成抗生物粘泥涂層的實驗中，涂層在55℃下保存3 h后，酶活性損失已高達50%[11]，由圖3可以看出，MWNTs和GO兩種載體材料均能使蛋白酶的穩(wěn)定性增強，且效果明顯.不加入MWNTs或GO時，聚合物基質(zhì)表面有很多能夠允許水分子通過孔隙，這就使水溶性酶分子很容易流失.當MWNTs或GO存在時，一方面酶分子可以吸附在載體上從而減少酶活的泄漏，另一方面固定化酶的加入使其附近的聚合物分子發(fā)生重組，最終改變聚合物分子的流動率，有效的將酶固定在復合膜內(nèi)[23].

表1 不同有機溶劑對固定化酶活性的影響Tab.1 Influence of differentorganic solvent on Enzyme activity

圖2 抗生物粘泥復合膜Fig.2 Antifouling films

圖3 復合膜的保存穩(wěn)定性Fig.3 Storagestability of GO-Enzyme-PMMA film and MWNTs-Enzyme-PMMA film

2.3.2 酶基抗生物粘泥復合膜的操作穩(wěn)定性研究

福建竹編的主要技法是“雀目法”，“雀目法”的“雀目”是指六角形透空雀目格，這是由4條篾連貫且交叉地編織而成的。因此，編織而成的竹編工藝品具有透空疏朗的效果。竹編可以通過漂白、染色、上漆獲得不同的顏色。漂白后的竹編顏色比較自然樸素，很好地保持了竹子本來的顏色。而染色竹編的顏色主要以老棕色為主，色調(diào)比較沉重，工序卻并不簡單，要經(jīng)過多次的染色后再進行磨光才能完成。此外，還有一種上漆竹編，是在竹編表面上漆，使竹編工藝品不僅具有竹編的外形，還具有漆器的質(zhì)感，因此顯得非常別致。上漆竹編的品種主要有瓶、盤、罐、籃、盒、燈罩、屏風、掛簾、枕席等[11]。

將加入固定化酶的復合膜連續(xù)6次放入新鮮的酪蛋白溶液中，以加入具有相同活力的胰蛋白酶粉的復合膜為參照，比較發(fā)現(xiàn)，在6次的反應中2種加入固定酶的復合膜均未見明顯的酶活損失現(xiàn)象，而加入酶粉的復合膜酶活降低很快.這與兩種載體材料特有的高表面積-體積比有關.超大的表面積使載體與酶能夠充分作用結合牢固，減少了酶的泄漏損失.同時，MWNTs固定酶的穩(wěn)定性要優(yōu)于GO固定酶，說明固定酶活性和穩(wěn)定性的提高不僅和碳納米材料的理化性質(zhì)有關，MWNTs的高曲率半徑和特有的化學性質(zhì)也起到了重要作用[23].

以上實驗結果表明，加入固定酶的復合膜穩(wěn)定性和重復使用性都優(yōu)于加入酶粉的復合膜.因此在后續(xù)實驗中，不再研究含酶粉的復合膜.

2.3.3 酶基抗生物粘泥復合膜的力學性能和親疏水性

圖4 復合膜的操作穩(wěn)定性Fig.4 Recycling stability of the films

如表2所示，在拉伸實驗中，不加入酶的PMMA膜抗拉強度為19.35MPa，斷裂伸長率6.6%.加入MWNTs固定酶后其抗拉強度為19.16MPa，斷裂伸長率8.56%，而加入GO固定酶的復合膜抗拉強度為18.96MPa，斷裂伸長率7.48%.固定化酶的加入使復合膜的抗拉強度略有降低，是因為碳納米材料自身表面能大，會產(chǎn)生團聚現(xiàn)象從而導致固定酶在PMMA中的分散不夠均勻.但加入固定酶的復合膜其斷裂伸長率都有所增加，是由于作為固定酶載體的MWNTs和GO具有很好的機械性能，據(jù)報道，GO可以增加復合材料的韌性，同時，MWNTs的管狀結構以及它與基體界面之間的弱作用力，如受力時存在MWNTs和基體之間的摩擦滑移、化學鍵的斷裂等，使得復合膜的斷裂伸長率增加[26-27].

表2 抗生物粘泥復合膜的拉伸實驗Tab.2 Tensile testing ofantifouling films

在親疏水性測試中，固定化酶的加入，對PMMA材料原本的親水性影響較小，如圖6所示，不含酶的PMMA膜接觸角為75°，而GO-Enzyme-PMMA和MWNTs-Enzyme-PMMA復合膜的接觸角則分別為68.4°和62.4°.復合膜的這些特性，使其具備了應用的可能性.

2.3.4 酶基抗生物粘泥復合膜的抗蛋白質(zhì)吸附性能

圖5 復合膜的靜態(tài)接觸角圖像Fig.5 Contactanglesof film

2.3.5 酶基抗生物粘泥復合膜的抗菌吸附性能

蛋白酶針對革蘭氏陰性菌和陽性菌具有防止抗生物粘泥形成的特性，且其中絲氨酸蛋白酶的效果尤其顯著.胰蛋白酶的抗菌原理不是直接殺滅微生物，而是通過降解粘細胞表面或其分泌的蛋白質(zhì)來實現(xiàn)控制生物粘泥的形成[28].實驗分別選擇E.coli（革蘭氏陰性菌）和S.aureus（革蘭氏陽性菌）2種常見菌來進行復合膜抗菌吸附實驗.結果如圖7所示，將復合膜表面單位面積吸附的細胞個數(shù)值取對數(shù)，GO-Enzyme-PMMA膜表面E.coli和S.aureus個數(shù)分別為3 467/cm2和7 244/cm2，MWNTs-Enzyme-PMMA膜的則為4 467/cm2和8 318/cm2.而不含酶的PMMA膜表面細胞個數(shù)遠大于前兩者1～2個數(shù)量級，分別為51286/cm2和467735/cm2.由此可以看出，GO-Enzyme-PMMA和MWNTs-Enzyme-PMMA復合膜具有顯著的抗菌效果.Regina等人還研究了加入變性的蛋白酶之后復合膜的抗菌性能，結果發(fā)現(xiàn)，變性酶并不能減少膜表面細胞的吸附[28].

圖6 復合膜表面牛血清白蛋白吸附量Fig.6 Amountof BSA adsorbed onto the films

圖7 復合膜表面吸附的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌數(shù)Fig.7 Theamountof E.coliand S.aureusadhered on the films

3 結論

1）以MWNTs和GO為載體固定化胰蛋白酶，使得固定化酶的催化活性和穩(wěn)定性得到一定程度的提高.其中MWNTs對酶的保護和活化作用更明顯.將固定化酶與PMMA結合，制備成酶基抗生物粘泥復合膜.GOEnzyme-PMMA膜在常溫、高溫條件下保存30 d后，相對酶活性分別為91%和82%.MWNTs-Enzyme-PMMA復合膜在兩種條件下保存30 d后，酶活性損失均為10%左右.連續(xù)使用六次后，GO-Enzyme-PMMA和MWNTs-Enzyme-PMMA膜的酶活性泄漏損失分別為10%和4%，與用胰蛋白酶粉制備的復合膜相比較，兩種含固定化酶的復合膜保存穩(wěn)定性和操作穩(wěn)定性均顯著提高.

2）實驗對兩種酶基抗生物粘泥復合膜進行了性能評價.首先，固定化酶的加入對PMMA材料本身的物理性質(zhì)影響不明顯；其次，GO-Enzyme-PMMA和MWNTs-Enzyme-PMMA膜與不含酶的PMMA膜相比，前兩者抗蛋白質(zhì)吸附能力是后者的4倍.而在抗菌實驗中，含固定化酶的復合膜表面細胞吸附個數(shù)少于不含酶的膜1～2個數(shù)量級.

與直接將生物酶溶解在水系統(tǒng)中去除生物粘泥的方法相比，酶基抗生物粘泥復合膜具有良好的穩(wěn)定性，可在一段較長的時間內(nèi)起到減少生物粘泥對材料表面附著的作用，解決了游離酶不利于回收，不可重復使用等問題.綜上所述，GO-Enzyme-PMMA和MWNTs-Enzyme-PMMA復合膜能夠有效的對抗生物粘泥的吸附，具有較好的應用前景.

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