化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測(cè)肝纖維化血清標(biāo)志物的性能評(píng)價(jià)

張運(yùn)洪，何 玲，黃建軍（江津區(qū)中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，重慶 402260）

肝纖維化甚至早期肝硬化如能及時(shí)發(fā)現(xiàn)并進(jìn)行抗纖維化治療，均是可以逆轉(zhuǎn)的。肝纖維化血清學(xué)指標(biāo)檢測(cè)的臨床應(yīng)用極為廣泛，能夠?yàn)榧膊≡\斷和患者預(yù)后判斷提供重要信息［1－2］。通常所說的肝纖維化四項(xiàng)（以下簡(jiǎn)稱肝纖四項(xiàng)）指標(biāo)即最為常用的肝纖維化血清學(xué)指標(biāo)，包括透明質(zhì)酸（HA）、層粘連蛋白（LN）、Ⅲ型前膠原 N端肽（PⅢP N－P）及Ⅳ型膠原（C－Ⅳ）。目前，化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)在上述指標(biāo)臨床檢測(cè)中的應(yīng)用已較為廣泛。本院2012年年底引進(jìn)了國產(chǎn)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀用于血清HA、LN、PⅢP N－P及C－Ⅳ檢測(cè)。根據(jù)美國病理家協(xié)會(huì)（CAP）和ISO15189文件對(duì)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量和能力的要求［3－4］，本實(shí)驗(yàn)室參照美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）的相關(guān)文件，結(jié)合通用的評(píng)價(jià)模式，對(duì)上述四個(gè)項(xiàng)目的檢測(cè)精密度、加樣針攜帶污染率、準(zhǔn)確度、線性范圍、參考區(qū)間進(jìn)行了驗(yàn)證和評(píng)價(jià)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 深圳市新產(chǎn)業(yè)生物醫(yī)學(xué)工程股份有限公司生產(chǎn)的MAGLUMI 2000Plus型全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及配套檢測(cè)試劑（試劑批號(hào)：HA為051120714，LN為049120904，PⅢP N－P為052120908，C－Ⅳ為050120907）和標(biāo)準(zhǔn)品?？伤菰粗撩绹鳶igma公司標(biāo)準(zhǔn)的LN、HA、C－Ⅳ質(zhì)控品及可溯源至美國Biodesign公司的PⅢP N－P質(zhì)控品，按使用量分裝，－20℃保存。

1.2 臨床標(biāo)本 臨床標(biāo)本為來源于本院的新鮮血清標(biāo)本，按使用量分裝，－20℃保存。

1.3 方法

1.3.1 精密度分析 參照 CLSI EP5－A2文件［5］，選取高低兩種濃度臨床標(biāo)本連續(xù)重復(fù)測(cè)定20次，計(jì)算批內(nèi)精密度，以批內(nèi)變異系數(shù)（CV批內(nèi)）表示，最大允許CV為廠家標(biāo)識(shí)CV批內(nèi)的1／2。選取高低兩種濃度臨床標(biāo)本連續(xù)測(cè)定20d，每天1次，計(jì)算批間精密度，以CV批間表示，最大允許CV批間為廠家標(biāo)識(shí)CV批間的1／2。

1.3.2 加樣針攜帶污染率分析 將高濃度標(biāo)本連續(xù)測(cè)量3次，測(cè)量值分別為H1、H2、H3；再將低濃度標(biāo)本連續(xù)測(cè)量3次，測(cè)量值分別人為 L1、L2、L3。攜帶污染率（%）＝（L1－L3）／（H3－L3）×100%。

1.3.3 準(zhǔn)確度分析 參照 CLSI EP15－A 文件［6］，對(duì)可溯源的質(zhì)控品進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果與已知靶值進(jìn)行比對(duì)，計(jì)算相對(duì)偏差。

1.3.4 線性范圍分析 參照 CLSI EP6－A 文件［7］，選取濃度達(dá)到給定的上、下限值標(biāo)準(zhǔn)的低值標(biāo)本（L）和高值標(biāo)本（H），按照5L＋0H、4L＋1H、3L＋2H、2L＋3H、1L＋4H、0L＋5H 的體積比例混合制備6個(gè)標(biāo)本，每個(gè)標(biāo)本重復(fù)測(cè)定3次后計(jì)算均值。將實(shí)測(cè)值與理論值進(jìn)行比較。以實(shí)測(cè)值為Y，理論值為X，計(jì)算回歸方程：Y＝aX＋b，要求相關(guān)系數(shù)（r）＞0.975或r2＞0.95，斜率a范圍為0.97～1.03，截距b與最高濃度比較接近0。

1.3.5 參考區(qū)間分析 參照CLSI C28－A2文件［8］，選取20例體檢健康者（男、女各10例）臨床標(biāo)本，檢測(cè)各指標(biāo)水平后建立參考區(qū)間，要求男、女健康者中，最多各允許有1例檢測(cè)結(jié)果超出推薦的參考區(qū)間。

2 結(jié) 果

2.1 精密度 （1）批內(nèi)精密度：批內(nèi)精密度分析結(jié)果見表1。結(jié)果表明肝纖四項(xiàng)的CV批內(nèi)均未超過5%，也未超過廠家允許最大CV批內(nèi)的1／2。（2）批間精密度：批間精密度分析結(jié)果見表2。結(jié)果表明肝纖四項(xiàng)的CV批間均未超過7.5%，也未超過廠家允許最大CV批間的1／2。

表1 肝纖四項(xiàng)檢測(cè)的批內(nèi)精密度評(píng)價(jià)試驗(yàn)結(jié)果

2.2 準(zhǔn)確度 可溯源的肝纖四項(xiàng)質(zhì)控品檢測(cè)及計(jì)算結(jié)果見表3。相對(duì)偏差均未超過±2%，優(yōu)于廠家允許相對(duì)偏差（±10.00%）。

2.3 加樣針攜帶污染率 肝纖四項(xiàng)高濃度標(biāo)本對(duì)低濃度標(biāo)本造成的攜帶污染率都小于廠家允許的最大攜帶污染率（1.00‰），見表4。

2.4 線性范圍 肝纖四項(xiàng)線性范圍評(píng)價(jià)試驗(yàn)結(jié)果見表5，對(duì)應(yīng)的線性散點(diǎn)圖見圖1～4?；貧w方程各參數(shù)（r2、a、b）如圖所示，都未超過1.3.4中要求的水平。計(jì)算獲得肝纖四項(xiàng)的線性范圍如下：HA 為12.84～1 897.76ng／mL，LN 為20.98～960.59ng／mL，PⅢP N－P為10.72～1 923.48ng／mL，C－Ⅳ為11.85～1 964.49ng／mL。

表2 肝纖四項(xiàng)檢測(cè)的批間精密度評(píng)價(jià)試驗(yàn)結(jié)果

表3 肝纖四項(xiàng)檢測(cè)的準(zhǔn)確度評(píng)價(jià)試驗(yàn)結(jié)果

表4 肝纖四項(xiàng)檢測(cè)的加樣針攜帶污染率評(píng)價(jià)試驗(yàn)結(jié)果

表5 肝纖四項(xiàng)檢測(cè)的線性范圍評(píng)價(jià)試驗(yàn)結(jié)果（ng／mL）

續(xù)表5 肝纖四項(xiàng)檢測(cè)的線性范圍評(píng)價(jià)試驗(yàn)結(jié)果（ng／mL）

圖1 HA線性散點(diǎn)圖

圖2 LN線性散點(diǎn)圖

圖3 PⅢP N－P線性散點(diǎn)圖

2.5 參考區(qū)間 廠家提供的肝纖四項(xiàng)參考區(qū)間如下：HA＜100ng／mL，LN＜50ng／mL，PⅢP N－P＜30ng／mL，C－Ⅳ＜30 ng／mL。本研究納入的男、女性各10例體檢健康者血清標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果均未出現(xiàn)1例或1例以上超過上述參考區(qū)間的現(xiàn)象，故可以直接使用廠家提供的參考區(qū)間。

圖4 C－Ⅳ線性散點(diǎn)圖

3 討 論

醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室將某種檢測(cè)方法應(yīng)用臨床實(shí)際工作之前，必須掌握檢測(cè)方法的性能指標(biāo)。一般情況下，儀器或試劑生產(chǎn)已能夠提供常用性能指標(biāo)的評(píng)價(jià)結(jié)果。但是在正式檢測(cè)臨床標(biāo)本、發(fā)出檢測(cè)報(bào)告前，醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室仍需對(duì)廠商提供的主要方法學(xué)性能評(píng)價(jià)結(jié)果予以驗(yàn)證和確認(rèn)［9］。因此，醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室必須結(jié)合實(shí)際，合理選擇方法學(xué)驗(yàn)證試驗(yàn)、系統(tǒng)設(shè)計(jì)方法學(xué)驗(yàn)證方案［10］。

檢測(cè)系統(tǒng)具有良好的重復(fù)性和無攜帶污染是方法學(xué)評(píng)價(jià)的前提和基本保障。本研究中，肝纖四項(xiàng)高低濃度標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果的CV批內(nèi)和CV批間均小于廠家允許最大變異系數(shù)的1／2。因此，可以認(rèn)為本研究中使用的化學(xué)發(fā)光免疫分析儀檢測(cè)肝纖四項(xiàng)的精密度是符合要求的。此外，本研究中的加樣針攜帶污染率分析結(jié)果也表明該分析儀的加樣針攜帶污染對(duì)標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果的影響是可以忽略的。

準(zhǔn)確度可以采用與已有檢測(cè)系統(tǒng)比較、與室間質(zhì)評(píng)結(jié)果比較、與質(zhì)控品或外部標(biāo)準(zhǔn)品“靶值”比較、與參比實(shí)驗(yàn)室比較、計(jì)算配制溶液標(biāo)本的回收率等5種形式來評(píng)估。由于肝纖四項(xiàng)無國際標(biāo)準(zhǔn)品，故本研究選擇可溯源的質(zhì)控品進(jìn)行檢測(cè)，相對(duì)偏差計(jì)算結(jié)果顯示，各項(xiàng)指標(biāo)的相對(duì)偏差均在可接受范圍內(nèi)，說明該分析儀檢測(cè)肝纖四項(xiàng)的準(zhǔn)確性是符合要求的。

可報(bào)告范圍應(yīng)和線性范圍一致或在線性范圍內(nèi)。本研究結(jié)果顯示該分析儀檢測(cè)肝纖四項(xiàng)的線性范圍是符合要求的。臨床標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果若超過線性范圍時(shí)，需對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證后方可發(fā)出報(bào)告。超過下限時(shí)，檢測(cè)結(jié)果對(duì)目前的診療缺乏指導(dǎo)意義。超過上限時(shí)，則應(yīng)在稀釋標(biāo)本后進(jìn)行在此檢測(cè)，但可稀釋的水平尚需驗(yàn)證。

醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室如果采用廠家提供的參考區(qū)間，則必須驗(yàn)證該參考區(qū)間是否適用于實(shí)驗(yàn)室所服務(wù)的人群。本研究隨機(jī)選擇了20例體檢健康者的標(biāo)本進(jìn)行驗(yàn)證，95%以上的檢測(cè)結(jié)果均在廠家提供的參考區(qū)間內(nèi)，因此，可以認(rèn)為廠家提供的參考區(qū)間基本適用于本實(shí)驗(yàn)室。

本研究結(jié)果顯示，MAGLUMI 2000Plus型全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀檢測(cè)肝纖四項(xiàng)的精密度、加樣針攜帶污染率、準(zhǔn)確度、線性范圍均符合預(yù)期要求，廠家提供的參考區(qū)間可以接受，可用于臨床標(biāo)本的肝纖四項(xiàng)檢測(cè)。

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［2］中華肝臟病學(xué)會(huì)肝纖維化組.肝纖維化診斷及療效評(píng)估共識(shí)［J］.中華肝臟病雜志，2010，10（5）：327－328.

［3］College of American Pathologists.Clinical Immunology Checklist［S］.IL，USA：College of American Pathologists，2006.

［4］中國合格評(píng)定國家認(rèn)可委員會(huì).ISO15189醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則［S］.北京：中國合格評(píng)定國家認(rèn)可委員會(huì)，2008：1－36.

［5］Clinical and Laboratory Standard Institute.Evaluation of precision performance of quantitative measurement methods.EP5－A2，Approved guideline－second edition［S］.Wayne，PA，USA：CLSI，2004.

［6］Clinical and Laboratory Standard Institute.User demonstration of performance for precision and accuracy.EP15－A，Approved guideline［S］.Wayne，PA，USA：CLSI，2001.

［7］Clinical and Laboratory Standard Institute.Evaluation of the Linearity of Quantitative Measurement Procedures.EP6－A，Statistical approved guideline［S］.Wayne，PA，USA：CLSI，2003.

［8］Clinical and Laboratory Standard Institute.How to define and determine reference intervals in the clinical laboratory.C28－A2，Approved guideline－second edition ［S］.Wayne，PA，USA：CLSI，2000.

［9］Centers for Medicare＆Medicaid Services.Clinical laboratory improvement amendments of 1988：final rule［Z］.Bal，USA：Centers for Medicare＆Medicaid Services，2003.

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