直接器官發(fā)生途徑的櫸樹微繁體系建立

劉雪梅，羅雪梅，王 征，金曉玲

(中南林業(yè)科技大學(xué)風(fēng)景園林學(xué)院，中國長沙 410004)

櫸樹(Zelkova schneideriana)不僅是珍貴的闊葉用材樹種［1-2］，也是重要的園林樹種［3］.由于過度采伐，我國的野生櫸樹資源已經(jīng)相當(dāng)匱乏［4］.組培快速繁殖技術(shù)能較好地保持母樹的優(yōu)良性狀，繁殖不受外界環(huán)境限制，因此該技術(shù)已經(jīng)在許多植物優(yōu)良品種的工廠化生產(chǎn)中得到應(yīng)用［5-6］.櫸樹組織培養(yǎng)技術(shù)的研究目前還處于初期階段［7］，主要利用莖尖或愈傷組織誘導(dǎo)的方法進(jìn)行增殖.但是利用莖尖培養(yǎng)的方法，具有繁殖系數(shù)低的缺點(diǎn)［8］，而利用愈傷組織誘導(dǎo)的途徑則后代容易產(chǎn)生變異［9］.本文擬建立通過櫸樹外植體直接器官發(fā)生途徑誘導(dǎo)不定芽或側(cè)芽的形成，再經(jīng)繼代和增殖培養(yǎng)獲得大量的不定芽，最后誘導(dǎo)生根成苗的櫸樹微繁技術(shù)體系.以期能在保持母樹優(yōu)良特性的前提下，提高不定芽的繁殖系數(shù)，為櫸樹工廠化育苗提供一定的技術(shù)支持.

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料栽植于中南林業(yè)科技大學(xué)校園內(nèi)，外植體為當(dāng)年生帶芽莖段，采集于選育出的櫸樹黃色品系的優(yōu)樹枝條，見圖1A.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 初代培養(yǎng) 基本培養(yǎng)基采用MS，附加不同濃度的BA，共設(shè)6個(gè)處理，每個(gè)處理4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)8個(gè)插穗，共32個(gè)插穗.25 d后統(tǒng)計(jì)腋芽萌發(fā)率、有效芽誘導(dǎo)率及芽平均生長高度.

1.2.2 繼代培養(yǎng) 當(dāng)初代誘導(dǎo)的不定芽長到1.5 cm左右時(shí)，將萌發(fā)的幼芽從基部切下，并接種到增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，基本培養(yǎng)基采用MS，附加了不同濃度的BA和NAA，共設(shè)9個(gè)處理(L9(34))，每個(gè)處理8個(gè)幼苗，重復(fù)4次，25 d后統(tǒng)計(jì)芽的增殖率、芽苗總數(shù)及芽苗的平均高度，計(jì)算增殖系數(shù).

1.2.3 壯苗培養(yǎng) 在壯苗培養(yǎng)試驗(yàn)中，以高1.0 cm左右的不定芽為試驗(yàn)材料.基本培養(yǎng)基采用MS，附加了不同濃度的BA和GA3，共設(shè)5個(gè)處理.每種處理8個(gè)幼苗，重復(fù)4次，25 d后觀察芽的生長狀況.

1.2.4 生根培養(yǎng) 將經(jīng)過壯苗培養(yǎng)的再生苗接種到生根培養(yǎng)基上，以1/2MS為基本培養(yǎng)基，附加了不同濃度的NAA和活性碳誘導(dǎo)生根，共設(shè)5個(gè)處理.每個(gè)處理8個(gè)幼苗，重復(fù)4次，25 d后統(tǒng)計(jì)平均生根率、平均生根條數(shù)、平均根長及平均莖高.

1.2.5 培養(yǎng)條件 培養(yǎng)基均附加瓊脂6 g/L，蔗糖30 g·L－1，pH為6.0.以上實(shí)驗(yàn)的培養(yǎng)條件均為培養(yǎng)溫度25±2 ℃，光照強(qiáng)度1 500 lx，光照時(shí)數(shù)14 h·d－1.

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞分裂素BA對(duì)櫸樹初代培養(yǎng)不定芽誘導(dǎo)的影響

細(xì)胞分裂素對(duì)櫸樹帶芽莖段誘導(dǎo)的影響結(jié)果見表1和圖1B.由表1可以看出，BA濃度對(duì)櫸樹帶芽莖段的萌發(fā)率、有效芽誘導(dǎo)率以及芽的平均高度等都有顯著影響，總體表現(xiàn)為隨著BA濃度的增加，萌發(fā)率逐漸提高，當(dāng)達(dá)到一定值后，隨著BA濃度的增加，芽的萌發(fā)率逐漸下降.當(dāng)BA濃度為2.25 μmol/L時(shí)，芽的萌發(fā)率為80%，當(dāng)BA濃度為4.50 μmol/L時(shí)，萌發(fā)率達(dá)到最大值83.33%，但兩者沒有顯著差異，有效芽誘導(dǎo)率達(dá)到76.67%，芽的平均高度也較高，2.6～3.0 cm，見圖1C;隨著BA濃度的增加，萌發(fā)率、有效芽誘導(dǎo)率以及芽的平均高度等都逐漸下降，當(dāng)BA濃度為35.8 μmol/L時(shí)，不定芽的誘導(dǎo)率只有30%，芽的高度不足0.5 cm，見圖1D.因此，櫸樹帶芽莖段的萌發(fā)需要較低濃度的BA，合適的初代培養(yǎng)基為MS+BA 2.25～4.5 μmol/L.

表1 櫸樹莖段初代培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.1 The results of Z.schneideriana stem initial culture

2.2 不同激素濃度對(duì)不定芽繼代和增殖的影響

BA和NAA的不同濃度和組合對(duì)櫸樹不定芽增殖的影響不同，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2.由表2可知，9種處理對(duì)不定芽增殖培養(yǎng)有顯著影響.其中E4不僅增殖系數(shù)最高，其有效苗數(shù)也最多，E4處理芽生長情況也是最好的，其培養(yǎng)基配方是MS+BA 2.25 μmol/L，增殖系數(shù)為5.1.對(duì)不定芽增殖系數(shù)進(jìn)行多因素方差分析，其結(jié)果見表3.

表2 櫸樹不定芽的繼代增殖培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 The shoots multiplication results of Z.schneideriana adventitious bud

表3 增殖倍數(shù)方差分析結(jié)果Tab.3 The variance analysis results of the multiplication rate

由表3可以看出，處理的總效應(yīng)達(dá)到了極顯著水平:F=318.190，P＜0.01，但BA和NAA之間的交互作用的效應(yīng)卻不顯著.進(jìn)一步對(duì)BA和NAA兩種因素進(jìn)行了多重比較，結(jié)果見表4和表5.

表4 BA 3水平的Duncan檢驗(yàn)Tab.4 Duncan's three level test for BA

由表4可知，試驗(yàn)中BA所選取的3個(gè)水平之間均存在極顯著的差異，BA為不定芽增殖的主要影響因素.從平均值來看，BA水平在2.25 μmol/L時(shí)，其平均值最高，為4.922.由表5可知，試驗(yàn)中NAA所選取的3個(gè)水平之間差異不顯著.從統(tǒng)計(jì)結(jié)果來看，在不定芽增殖階段不添加生長素NAA最好.

表5 NAA 3水平的Duncan檢驗(yàn)Tab.5 Duncan's three level test for NAA

綜上所述，BA是影響不定芽增殖培養(yǎng)的主要因子，NAA及其與BA的交互作用對(duì)增殖的結(jié)果效果不顯著.因此，櫸樹不定芽繼代增殖培養(yǎng)最優(yōu)培養(yǎng)基配方為MS+BA2.25 μmol/L，即E4組合，見圖1E，F(xiàn).

2.3 不同激素濃度及組合對(duì)不定芽壯苗培養(yǎng)的影響

為了使組培苗健壯，在基本培養(yǎng)基中添加了不同濃度配比的BA和GA3，結(jié)果見表6.由表6可知，單獨(dú)使用BA，櫸樹不定芽能生長;單獨(dú)使用GA3不能促進(jìn)不定芽生長;BA和GA3的配合使用能促進(jìn)不定芽生長和壯苗，但試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，低濃度的GA3(1.45 μmol/L)可以達(dá)到壯苗的目的，過高濃度的GA3反而會(huì)抑制不定芽的生長(2.9 μmol/L).因此，櫸樹不定芽壯苗適宜的培養(yǎng)基為 MS+BA 2.25 μmol/L+GA31.45 μmol/L，見圖1G.

圖1 櫸樹直接器官發(fā)生途徑植株再生過程A.帶芽壯苗培養(yǎng)莖段外植體;B.初代培養(yǎng);C.MS+BA 2.25 μmol/L;D.MS+BA 35.8 μmol/L;E.繼代培養(yǎng);F.增殖培養(yǎng);G.壯苗培養(yǎng);H.生根培養(yǎng);I.1/2MS+NAA 2.69 μmol/L+活性炭0.1 g·L－1Fig.1 The process of plantlet rgeneration through direct organogenesisA.Stems with a bud as explants;B.Initiation culture;C.Adventitious buds on MS+BA 2.25 μmol/L;D.Adventitious buds on MS+BA 35.8 μmol/L;E.Subculture;F.Propagation;G.Culture for sound seedling;H.Rooting culture;I.Rooting on 1/2MS+NAA 2.69 μmol/L+activated carbon 0.1 g·L －1

表6 櫸樹不定芽的壯苗培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果Tab.6 The results of shoots on strong seedlings culture

2.4 不同濃度的NAA和活性炭對(duì)不定芽生根培養(yǎng)的影響

不同濃度的NAA和活性炭對(duì)櫸樹不定芽生根培養(yǎng)的影響見表7.由表7可知，在試驗(yàn)所選取的濃度中，生根培養(yǎng)基中添加較高濃度的NAA和較低濃度的活性炭有利于櫸樹不定根的誘導(dǎo)和生長.適宜的櫸樹不定芽生根培養(yǎng)基配方為 I4，即 1/2MS+NAA 2.69 μmol/L+0.1 g·L－1活性炭，生根率 77.8%，生根數(shù)達(dá) 4.5條，見圖1H，I.

表7 櫸樹生根培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果Tab.7 The experimental data of Z.schneideriana rooting

3 結(jié)論與討論

木本植物器官發(fā)生過程中，植物生長調(diào)節(jié)劑對(duì)不定芽的誘導(dǎo)和生長發(fā)育起著重要的作用，在直接誘導(dǎo)不定芽的形成時(shí)，細(xì)胞分裂素應(yīng)高于生長素的用量或只用細(xì)胞分裂素.已有研究表明［7-9］，直接誘導(dǎo)櫸樹不定芽形成時(shí)，只用細(xì)胞分裂素或細(xì)胞分裂素高于生長素的用量誘導(dǎo)效果好.因此，在初代培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中只考慮細(xì)胞分裂素對(duì)櫸樹帶芽莖段誘導(dǎo)的影響.這與周燕青等［10］對(duì)條葉榕的組織培養(yǎng)研究結(jié)果相似.

以當(dāng)年生帶芽莖段為外植體，建立起了櫸樹外植體通過器官發(fā)生途徑直接誘導(dǎo)形成不定芽或側(cè)芽，再通過誘導(dǎo)生根而成苗的櫸樹微繁技術(shù)體系:最適誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+BA 2.25 μmol/L或2.50 μmol/L;最適增殖培養(yǎng)基為 MS+BA 2.25 μmol/L;最適壯苗培養(yǎng)基為 MS+BA 2.25 μmol/L+GA3 1.45 μmol/L;最適生根培養(yǎng)基為1/2MS+NAA 2.69 μmol/L+活性炭0.1 g·L－1.櫸樹不定芽誘導(dǎo)生根的試驗(yàn)設(shè)計(jì)中只選擇了NAA一種生長素，常用的IBA或NAA與IBA混合使用效果是否更好還有待進(jìn)一步研究.

離體器官發(fā)生方式大致分為直接器官發(fā)生和間接器官發(fā)生2種方式.間接器官發(fā)生途徑再生不定芽的細(xì)胞突變率較高，不利于保持原植株的母本優(yōu)良性狀，而直接器官發(fā)生途徑則能很好的保持母本的優(yōu)良特性，而且直接誘導(dǎo)的不定芽與通過愈傷組織誘導(dǎo)產(chǎn)生的不定芽相比，前者不僅繁殖周期短，而且不定芽生長速度快［11］.這為進(jìn)一步研究櫸樹工廠化育苗提供了一定的參考.

由于櫸樹是高大的落葉喬木，其組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)要真正應(yīng)用于工廠化生產(chǎn)還有許多問題需要解決，如外植體的采樣時(shí)間和采樣母樹的樹齡是否對(duì)不定芽的誘導(dǎo)產(chǎn)生影響等等.

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