一例肥豬“猝死征”的病原分離與分析

鄔向東，陶明華，陳如圣，陶明江，張祥華，陳瑞光

（1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動科院，江西 南昌 330045；2.上海海利生物技術(shù)股份有限公司）

豬猝死征主要是由魏氏梭菌混合其它細菌共同引起的一種急性死亡癥。魏氏梭菌廣泛存在人畜糞便、土壤、水等環(huán)境中，該菌群屬典型的條件性致病菌，它可引發(fā)地區(qū)性流行病，每年都有大量的動物因不同類型魏氏梭菌感染而死亡。尤其是近年來我國發(fā)生家畜猝死征與該菌有關(guān)，發(fā)病急、病程短、無任何前期癥狀而突然死亡，而且死亡率極高。一般發(fā)生于育肥豬、母豬，呈散發(fā)性流行。

2013年12月，江西農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)院接診一例育肥急性死亡病例，表現(xiàn)為100kg左右的育肥豬突然死亡，死后口鼻流出帶血的泡沫狀液體。當(dāng)?shù)孬F醫(yī)診斷為傳染性胸膜肺炎，但治療效果不理想，轉(zhuǎn)到獸醫(yī)院檢測，診斷為“猝死征”，病原分離得到兩株細菌，分別為大腸桿菌(JXV-E1203)和魏氏梭菌(JXV-C1203)，根據(jù)檢測結(jié)果針對性用藥，疫情得到控制，現(xiàn)將病原分離與分析情況介紹如下。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 病料。某豬場送來的3頭急性死亡肥豬，剖檢后采集肝臟、脾臟、心血、腸內(nèi)容物為細菌分離病料。

1.1.2 主要試劑、培養(yǎng)基。革蘭氏染色液、鮮血培養(yǎng)基、牛奶培養(yǎng)基、麥氏比濁管等參照文獻自行配制；藥敏紙片。

1.2 方法

1.2.1 細菌分離培養(yǎng)。在超凈工作臺中，以無菌操作，用接種環(huán)從病料中鉤菌，劃線接種于鮮血培養(yǎng)基進行需氧培養(yǎng)；另采腸道和肝微生物接種于石蕊牛乳培養(yǎng)基，80℃處理30min后，進行厭氧培養(yǎng)。

1.2.1.1 需氧培養(yǎng)。將接種細菌的鮮血培養(yǎng)基，置37℃普通大氣環(huán)境中，于恒溫箱中恒溫培養(yǎng)24～48h，觀察有無可疑菌落生長，并記錄結(jié)果。

1.2.1.2 厭氧培養(yǎng)。將接種細菌的石蕊牛乳培養(yǎng)基置37℃培養(yǎng)18～24h，觀察有無“暴烈發(fā)酵”現(xiàn)象，如有，從試管中鉤菌接種鮮血培養(yǎng)基，置厭氧缸中37℃厭氧培養(yǎng)24～48h，觀察有無可疑菌落生長。

1.2.2 細菌生化鑒定。參照文獻進行操作，將分離純化的菌株JXV-E1203，分別接種糖發(fā)酵微量發(fā)酵管、蛋白胨水、糖葡萄蛋白水、檸檬酸鹽利用發(fā)酵管，37℃培養(yǎng)24～48h觀察糖發(fā)酵管顏色變化，同時進行V-P試驗、M-R試驗、吲哚試驗檢測，觀察結(jié)果。

表1 JXV-E1203攻毒小鼠分組及試驗結(jié)果 只，mL，%

1.2.3 細菌小鼠攻毒（見表1）。將需氧分離純化革蘭氏陰性菌株（JXV-E1203）接種鮮血培養(yǎng)基37℃恒溫靜置培養(yǎng)18h，加無菌生理鹽水，將菌苔刮至生理鹽水中獲得菌懸液，再將菌液與麥氏比濁管比較，估算菌數(shù)后稀釋為3×108CFU/mL，作為小鼠攻毒試用菌液。

隨機選擇6只相同小鼠，隨機分為3組，每組兩只，將攻毒菌液分別稀釋成3×108CFU/mL和3×107CFU/mL兩個濃度進行分別攻毒，每只皮下注射0.1mL。對照組小鼠每只皮下注射生理鹽水0.1mL。攻毒后3組給予同樣的飼養(yǎng)環(huán)境，每天觀察記錄發(fā)病及死亡情況，連續(xù)觀察一周。死亡小鼠及時剖檢，用肝臟重新分離細菌。

2 試驗結(jié)果

2.1 細菌分離結(jié)果

分離菌株JXV-E1203在普通大氣環(huán)境下37℃培養(yǎng)24h，生長良好，形成中等大小、光滑、濕潤、邊緣整齊、水滴樣菌落，呈明顯β溶血（圖1）。

圖2 JXV-C1203厭氧培養(yǎng)呈雙溶血環(huán)

分離菌株JXV-C1203在石蕊牛乳培養(yǎng)基置37℃培養(yǎng)18h呈“暴烈發(fā)酵”，在厭氧缸無氧環(huán)境下37℃培養(yǎng)24h后，可見細菌生長良好，形成直徑2～5mm、表面光滑、半透明的菌落，菌落周圍有雙溶血環(huán)（見圖2）。

2.2 細菌染色鏡檢結(jié)果

將需氧分離到的菌株JXV-E1203進行革蘭氏染色，發(fā)現(xiàn)細菌呈球桿狀菌，兩端鈍圓，中等大小，單個存在，有時成雙排列，革蘭氏染色陰性（見圖3）。

圖3 需氧分離菌株革蘭氏染色結(jié)果

將無氧分離到的菌株JXV-C1203進行革蘭氏染色，菌體呈粗大直桿狀，兩端鈍圓，單在或成雙排列，革蘭染色陽性（見圖4）。

圖4 厭氧分離菌株革蘭氏染色結(jié)果

2.3 細菌生化鑒定結(jié)果

普通大氣分離菌株JXV-E1203，接種微量生化發(fā)酵管，結(jié)果該菌能分解葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、甘露醇、木糖，不分解鼠李糖、楊苷；V-P試驗陰性、M-R試驗陽性、吲哚試驗陽性，初步鑒定為大腸桿菌。

2.4 細菌小鼠攻毒結(jié)果

小鼠攻毒結(jié)果見表1。高低劑量兩組試驗組小鼠分別在第3、4d全部死亡，死亡小鼠均表現(xiàn)肛門出血（見圖5）。

圖5 死亡小鼠肛門出血

剖解可見小鼠表面嚴重的敗血變化，肝臟、腎臟壞死出血，脾臟出血，整個腸道充滿帶血的粘液，腸道出血嚴重（見圖6）。

圖6 剖小鼠內(nèi)臟出血、腸充血

3 小結(jié)與討論

3.1 本病例經(jīng)臨床癥狀觀察、病理剖檢初診為育肥豬的“猝死征”，通過需氧和厭氧細菌分離，分離鑒定出兩株細菌，分別命名為JXV-E1203、JXVC1203。JXV-E1203經(jīng)生化鑒定為大腸桿菌，小鼠攻毒具有較強的毒力，每只小鼠攻毒3×106CFU/只，即可至死；而且死亡小鼠均表現(xiàn)出腸道出血。厭氧分離菌株JXV-C1203在牛奶培養(yǎng)基培養(yǎng)表現(xiàn)出“暴烈發(fā)酵”現(xiàn)象，在血平板上厭氧培養(yǎng)呈雙溶環(huán)血環(huán)，為革蘭氏陽性大桿菌，初步判斷為魏氏梭菌。JXVC1203雖未做攻毒試驗，但其溶血十分嚴重，可能也有致病力。

3.2 “肥豬猝死征”是一種病原較復(fù)雜的疾病，其病因與應(yīng)激相關(guān)，病原相對復(fù)雜，一般認為與魏氏梭菌相關(guān)，但常有其它細菌混合感染。本次試驗發(fā)現(xiàn)出血變化是其特征，病原分離得到魏氏梭菌和大腸桿菌，這與以往報道主要是魏氏梭菌與巴氏桿菌混合感染有所不同。

該病目前雖不是常見病，但來勢兇猛，常發(fā)于成年動物，損失也比較嚴重。臨床表現(xiàn)出癥狀后難以治療，且死亡率很高，應(yīng)引起養(yǎng)殖戶和獸醫(yī)技術(shù)人員的重視。魏氏梭菌常與其它菌混合感染，如臨床上已分離到巴氏桿菌、大腸桿菌、鏈球菌、葡萄球菌、沙門氏菌、肺炎克雷伯氏菌，但也有單獨感染的。

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