零余子黃酮類化合物的提取工藝優(yōu)化及初步分離

廖兆貴

(恩施市舞陽農(nóng)業(yè)服務(wù)中心，湖北恩施445000)

零余子為薯蕷科植物薯蕷(Dioscoreaopposita Thunb.)葉腋間的珠芽［1－2］，俗稱“山藥豆”，呈卵圓形或橢圓形，直徑約0.4～2cm，外表皮淡黃色，有細(xì)皺紋，頂端中間略有莖痕，質(zhì)堅(jiān)硬，斷面黃褐色角質(zhì)樣，亦有光澤.氣味淡而不苦，口嚼粘膩，零余子含有16種氨基酸、膽堿、尿素、植酸、多種維生素、淀粉酶、山藥素等物質(zhì)，自古就是營養(yǎng)價(jià)值很高的滋補(bǔ)食品和藥用價(jià)值很高的藥材，可食用，還具醫(yī)療價(jià)值.

植物黃酮含量測定中最為關(guān)鍵的一步是黃酮的提取，不同的溶劑對不同植物黃酮的提取能力又有明顯的不同，因而提取溶劑的選擇至關(guān)重要［3］.黃酮類物質(zhì)的分離純化的方法有很多，有大孔樹脂的柱層析、紙層析、高效液相色譜技術(shù)等，但紙層析是黃酮類物質(zhì)的傳統(tǒng)而適應(yīng)面廣的一種純化技術(shù).通過資料檢索發(fā)現(xiàn)，目前對零余子的研究報(bào)道較少，而對其黃酮的研究未見報(bào)道，同時(shí)現(xiàn)已證實(shí)，黃酮類化合物具有多種生理功能和藥用價(jià)值［4－5］，因此本文主要對零余子的黃酮的提取工藝及初步分離進(jìn)行了探討.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

零余子粉:經(jīng)干燥粉碎后過40目篩收集于棕色試劑瓶中，備用.

1.2 試驗(yàn)試劑

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(≥95%)、無水乙醇、甲醇、丙酮、亞硝酸鈉、硝酸鋁、正丁醇、冰醋酸、異丙醇、濃氨水以上試劑均為分析純(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司).

1.3 儀器設(shè)備

UV1900PC紫外光譜儀(上海亞研電子科技有限公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠);SHZ－CB型循環(huán)水式多用真空泵(河南鞏義市英裕予華儀器廠);電子恒溫水浴鍋(深圳國華儀器廠);FA2104電子天平(上海天平儀器廠);800B離心機(jī)(上海安亭儀學(xué)儀器廠);85－2恒溫磁力攪拌機(jī)(江蘇中大儀器廠);紫外燈;層析缸等.

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 薯蕷零余子黃酮化合物的溶劑優(yōu)化 稱取三份零余子粉，各0.5 g，分別按料液比為1∶20加入60%甲醇，60%乙醇，60%丙酮進(jìn)行回流提取，提取時(shí)間為2 h，提取次數(shù)為1次，提取溫度為75℃.將提取液離心(4000 r/min，15 min)，收取上清液定容至50 mL，取2 mL測定吸光度值，確定最佳提取溶劑.

1.4.2 零余子黃酮的提取工藝優(yōu)化 以乙醇為溶劑，選擇提取溫度、溶劑的體積分?jǐn)?shù)、回流時(shí)間、回流次數(shù)4個(gè)因素，料液比均為1∶20，采用L9(34)正交設(shè)計(jì)，從而對其提取條件進(jìn)行優(yōu)化，因素和水平見表1.

提取時(shí)準(zhǔn)確稱取0.5 g的零余子粉9份按正交設(shè)計(jì)表分別提取，將提取液過濾，離心，定容后測定吸光度值［6］.

1.4.3 黃酮的測定方法 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作:配制濃度為1.0 mg/mL 的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，吸取0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液(相當(dāng)于0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg 蘆丁)分別置于 10 mL容量瓶中，再加5%亞硝酸鈉溶液0.3mL，搖勻，加10%硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻，加入4%氫氧化鈉溶液4 mL，再加乙醇稀至刻度，搖勻，放置12 min后，用1 cm比色皿，在波長510 nm處測定吸光度 A［7］.以蘆丁含量(mg)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，用最小二乘法進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程 A=0.0065+1.0057C，r=0.9998.

薯蕷零余子黃酮的測定:將提取液離心(4000 r/min，15 min)，定容至50 mL的棕色容量瓶，移取2 mL提取液入10 mL容量瓶中，測定方法同標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)回歸方程計(jì)算測試液中黃酮含量C(mg)，則樣品中黃酮含量計(jì)算式為:

表1 因素水平表Tab.1 The factors and levels

其中:T為為供試液總量(mL);V為測定時(shí)吸取的樣品量(mL);W為樣品重量(g).

1.4.4 回收率試驗(yàn)［8］取3個(gè)10 mL容量瓶，在已知黃酮含量的提取液中分別加一定體積的1.0 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)對照品溶液，分別測其黃酮含量，根據(jù)所測得的黃酮量減去提取液中黃酮含量，再除以加標(biāo)量即可計(jì)算回收率.

1.4.5 零余子黃酮的紙層析分離純化 試驗(yàn)選取三種不同的展層劑，第一種為雙向紙層析［9－10］:

1)第一展開劑為正丁醇∶冰醋酸∶水=3∶1∶1，第二展開劑15%醋酸(HOAC)，取濃縮液10 μL，將其點(diǎn)析濾紙(16 cm×16 cm)右下角距層析紙兩邊距離各3.5 cm處，反復(fù)點(diǎn)樣，吹干，使其直徑控制在3 mm左右.將點(diǎn)好樣品的層析紙放入盛有第一展開劑的層析缸中，采用上行法，使樣品斑點(diǎn)與展開劑液面相距1 cm左右.蓋好層析缸，當(dāng)展開劑的前沿上行至距紙邊約3 cm左右時(shí)，取出層析紙晾干.將風(fēng)干的層析紙旋轉(zhuǎn)90℃，放入盛第二展開劑的層析缸中，方法同上.

2)第二種展層劑為甲醇∶水∶異丙醇=20∶1∶3［11］，取濃縮液10 μL，點(diǎn)樣于新華慢性層析紙上，直至在紫外燈下呈1 cm的綠色斑點(diǎn)為止.將層析紙放入層析缸內(nèi)展開.當(dāng)溶劑前沿到達(dá)離層析紙前沿約3 cm時(shí)將層析紙從缸中取出，用鉛筆標(biāo)出溶劑前沿，再將其吹干.

3)第三種展層劑為甲醇:冰醋酸:水=20∶15∶85，點(diǎn)樣和展層方法同第二種.

1.4.6 紫外燈檢查 將得到的干燥的層析紙先在紫外燈下觀察，紀(jì)錄觀察結(jié)果，而后用氨氣熏，將盛有濃氨水的100 mL廣口瓶的瓶口與每個(gè)斑點(diǎn)接觸約5s，再于紫外燈下觀察，紀(jì)錄其顏色變化［10］.

1.4.7 黃酮體比移值Rf的測定 將在紫外燈下有熒光的斑點(diǎn)用鉛筆一一標(biāo)點(diǎn)，并用刻度尺量取原點(diǎn)到每一個(gè)熒光斑點(diǎn)圓心的距離和原點(diǎn)到溶劑前沿的距離.計(jì)算比移值Rf.

比移值=原點(diǎn)到黃酮體斑點(diǎn)中心的距離/原點(diǎn)到溶劑前沿的距離

2 結(jié)果分析

2.1 零余子黃酮化合物的提取溶劑優(yōu)化

由圖1可以看出，不同的提取溶液對黃酮的提取有一定的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明甲醇的提取黃酮能力最低，而丙酮的其次，乙醇的提取效果最好.

2.2 零余子黃酮的提取工藝優(yōu)化

試驗(yàn)選取乙醇濃度(A)、回流時(shí)間(B)、回流次數(shù)(C)、回流溫度(D)四個(gè)因素進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗(yàn)，具體結(jié)果見表3，試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行極差分析和方差分析.

圖1 不同浸提溶劑對黃酮得率的影響Fig.1 The influence of bleaching solvent on the flavonoid yield

表2 L9(34)黃酮提取的正交試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 The results of orthogonal experiment

以K值作各因素不同水平的黃酮得率的直觀效果圖，見圖2.

采用SPSS 11.5軟件對表3實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3.

圖2 各因素水平的直觀效果圖Fig.2 The visual chart of all factors and levels

表3 正交實(shí)驗(yàn)方差分析表Tab.3 The analysis of variance of the orthogonal experiment

由表3的極差分析可以得出黃酮化合物的最佳工藝是A3B2C3D2，結(jié)合表4的方差分析可以看出影響其得率的主次因素是A＞D＞B＞C，即乙醇的濃度最為顯著，其次是提取溫度，回流時(shí)間和回流次數(shù).隨著溶液濃度的提高和回流次數(shù)的增加，黃酮得率提高，隨著回流時(shí)間的增加得率先是較大幅度的提高而后有小幅下降，而提取溫度的增加先使得得率有所增加，但到75℃后影響不大.表5中各個(gè)因素水平的方差分析表也說明A、B、C三因素的各個(gè)水平間差異非常顯著，而D因素的2、3水平間差異不顯著.驗(yàn)證試驗(yàn)得出薯蕷零余子黃酮得率最高為5.494 mg/g.

表4 各個(gè)因素的各水平顯著性分析Tab.4 The significant analysis of different levels

2.3 回收率實(shí)驗(yàn)

回收率是判斷分析結(jié)果的量化指標(biāo)，也是重要的質(zhì)控手段，為了衡量零余子前處理過得和測試過程中黃酮類物質(zhì)的保留情況，本文進(jìn)行了回收率的測定，具體見表6.由表6可見，回收率為98% ～102%，說明樣品處理及測試方法可行.

表6 零余子黃酮含量回收率試驗(yàn)Tab.6 Recovery experiment results of flavonoid levels from Yams bubil

2.4 零余子黃酮的初步分離

經(jīng)過對不同的展層劑系統(tǒng)的層析紙熒光斑點(diǎn)的觀察，雙向紙層析和甲醇:水:異丙醇系統(tǒng)層析的熒光斑點(diǎn)呈現(xiàn)一條黃綠色光帶，而甲醇:冰醋酸:水系統(tǒng)層析的熒光斑點(diǎn)均勻分布并呈現(xiàn)不同的顏色，具體結(jié)果見圖3，故選用甲醇:冰醋酸:水為最佳展層劑.

以甲醇∶冰醋酸∶水(20∶15∶85)為紙層析的溶劑系統(tǒng)，經(jīng)紙層析并于紫外燈下檢查，以乙醇提取的黃酮被分離為4部分，第1部分顯紫紅色，2，3部分呈較淡的黃綠色，第4部分顯黃綠色，氨氣熏蒸后熒光顏色均不變，比移值分別是 Rf1=0.096，Rf2=0.280，Rf3=0.592，Rf4=0.771.

3 結(jié)論

1)零余子黃銅提取的最佳提取溶液為乙醇，乙醇提取零余子黃酮的最佳提取工藝是用80%的乙醇，回流時(shí)間為3h，回流次數(shù)為3次，提取溫度為75或85℃，最大得率為5.494mg/g.此時(shí)平均回收率為99.41%

2)采用紙層析對零余子黃酮進(jìn)行分離純化，最佳展層劑為甲醇:冰醋酸:水=20:15:85，可將零余子黃酮分離為四種成分，但這四種成分的具體性質(zhì)還有待于研究.

圖3 零余子黃酮的紙層析Fig.3 The paperchromatograph map of flavonoids

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