我國淫羊藿藥材主要活性成分變異分析

孫紫薇，雷 燦，鄭小江，2*

(1.湖北民族學(xué)院林學(xué)園藝學(xué)院，湖北恩施445000;2.湖北民族學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北恩施445000)

淫羊藿是我國最著名的中草藥之一，在日本、朝鮮以及地中海地區(qū)也被作為藥用植物［1－2］.2002年，我國衛(wèi)生部頒布實(shí)施的《關(guān)于進(jìn)一步規(guī)范保健食品原料管理的通知》將淫羊藿列入可用于保健食品的中草藥名單.對(duì)一些具有顯著保健功效的中草藥進(jìn)行藥食兼用食品研究開發(fā)也是中藥現(xiàn)代化的一個(gè)重要發(fā)展方向.淫羊藿含有黃酮類、多糖、生物堿、木脂素、萜類、綠原酸、必需脂肪酸、苯類化合物和微量元素等多種營養(yǎng)成分和生物活性物質(zhì)，具有抗骨質(zhì)疏松、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫等藥理活性［3］.以淫羊藿苷為主的黃酮類化合物是淫羊藿的主要活性成分，主要是因?yàn)橐蜣街悬S酮類化合物具有雌激素樣作用，對(duì)人體生理代謝具有重要的調(diào)節(jié)功能［4］.2005年《中華人民共和國藥典》規(guī)定，淫羊藿藥材來源為小檗科淫羊藿屬的淫羊藿(Epimedium brevicornum)、箭葉淫羊藿(E.sagittatum)、巫山淫羊藿(E.wushanense)、柔毛淫羊藿(E.pubescens)和朝鮮淫羊藿(E.koreanum)五個(gè)種.然而，淫羊藿屬植物在我國廣泛分布，達(dá)45種之多，多為狹布種［5］.幾乎全國各地都采集當(dāng)?shù)匾吧蜣阶鳛樗幉某鍪刍蛘呷胨?各地野生淫羊藿以淫羊藿苷為主的黃酮類化合物含量差異顯著.由此導(dǎo)致各地采收的淫羊藿藥材的質(zhì)量不一致，嚴(yán)重影響其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn).

中藥材質(zhì)量控制和藥材標(biāo)準(zhǔn)化是中藥現(xiàn)代化的最基礎(chǔ)性研究工作.藥材混亂或質(zhì)量參差不齊嚴(yán)重制約著我國中藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展效益和國際市場開拓.基于此，我國已經(jīng)先后建立了多個(gè)中藥材GAP基地，如橘梗、北沙參、板藍(lán)根、人參、紅花、柴胡、太子參、遠(yuǎn)志、云木香、黃芪、黃芩、車前等等［6］.但是，關(guān)于淫羊藿的GAP研究，雖然近些年來有較多的研究報(bào)道，但是大多集中在:活性成分的鑒定和檢測方法、藥理學(xué)研究、個(gè)別種內(nèi)或種間的活性成分變化研究、生態(tài)環(huán)境的研究等等.關(guān)于淫羊藿市售藥材的質(zhì)量現(xiàn)狀和藥典規(guī)定的五個(gè)淫羊藿物種的活性成分差異以及種內(nèi)活性成分變異尚未有系統(tǒng)研究報(bào)道.基于此本文進(jìn)行了相關(guān)研究，為淫羊藿這一著名中藥材的資源利用、種質(zhì)改良和GAP研究提供理論依據(jù).

1 試驗(yàn)儀器和藥品

STI501高效液相色譜儀(杭州賽智科技);STI UV501紫外可見檢測器;Lichrospher C18色譜柱(4.6×250 mm，江蘇漢邦科技);N2000色譜工作站和STI501泵;紫外可見分光光度計(jì)UV756CRT(上海佑科儀器公司);超聲波發(fā)生器(深圳潔泰超聲清洗公司，PS－40，40 kHz，240 w);電子分析天平以及其它實(shí)驗(yàn)室常用設(shè)備.乙腈(HPLC級(jí));乙酸(分析純).淫羊藿苷、朝藿定A，B，C標(biāo)準(zhǔn)品購自中國藥品與生物制品檢定所.

2 試驗(yàn)方法

2.1 分析條件

供試品溶液的制備:干燥淫羊藿樣品制備前在80℃烘干至恒重，然后粉碎，過60目藥典篩，所得粉末用于樣品分析.成分提取參照張華峰等［7］，略作修改:精密稱取淫羊藿藥材粉末約1.0 g，加入50%乙醇20 mL，稱重，超聲提取1 h，冷卻至室溫，稱重，補(bǔ)重，濾過，如此循環(huán)提取三次，合并濾液，過0.22 μm濾膜，作為供試品溶液.標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立:用70%乙醇分別溶解朝藿定A、B、C和淫羊藿苷標(biāo)準(zhǔn)品，配成梯度濃度的對(duì)照品采用外標(biāo)法，通過測定各成分相應(yīng)的峰面積與該成分的質(zhì)量的比值建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表1.

表1 HPLC分析淫羊藿苷、朝藿定A、B、C標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)Tab.1 Data of calibration curv for HPLC determination on Icariin and EpimedinA，B，and C

精密度試驗(yàn):混合對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣5次，朝藿定A，B，C及淫羊藿苷的峰面積值的RSD%分別為1.55%、1.24%、1.03%、1.27%，精密度良好.此外重復(fù)性 RSD%在0.92% ～1.87%.穩(wěn)定性 RSD%在1.31% ～3.88%.說明建立的方法重復(fù)性良好，方法可行，樣品具有較好的穩(wěn)定性.回收率在95.65% ～102.17%，說明在該儀器系統(tǒng)內(nèi)該方法具有良好的準(zhǔn)確度.

淫羊藿藥材總黃酮的測定，采用藥典規(guī)定的方法:提取液在270 nm下測定，以淫羊藿苷為標(biāo)準(zhǔn)品計(jì)算總黃酮含量.以淫羊藿苷為標(biāo)準(zhǔn)品計(jì)算出的標(biāo)準(zhǔn)方程為:Y=44.873X+0.025，R2=0.9998，在5.02% ～15.36 μg/mL范圍內(nèi)呈規(guī)律性的線性關(guān)系.

2.2 各地藥材的采集和分析

在浙江杭州、湖北武漢、安徽毫州、河南信陽、青海西寧、內(nèi)蒙古巴盟、陜西周至、甘肅蘭州、湖北恩施、重慶涪陵等地中藥材店購買淫羊藿藥材飲片，按照本文2.1樣品制備方法進(jìn)行制備提取.

根據(jù)藥典描述和中國植物志描述的特征，野外采集藥典規(guī)定的五個(gè)淫羊藿物種的盛花期葉片硅膠干燥備用.以巫山淫羊藿為例，采集湖北巴東、湖北恩施大峽谷、湖北恩施望城坡、湖北建始縣、湖北宣恩縣、湖南龍山縣、重慶巫山縣、湖北神農(nóng)架木魚鎮(zhèn)、貴陽等地的巫山淫羊藿盛花期葉片，硅膠干燥，按照本文2.1樣品制備方法進(jìn)行制備提取.

3 結(jié)果與分析

3.1 市場流通的淫羊藿藥材中的淫羊藿苷等四個(gè)成分差異顯著

杭州購買的淫羊藿藥材的淫羊藿苷和總黃酮含量最高，分別達(dá)到1.62%、9.66%，如表2所示.達(dá)到或超過藥典規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)(淫羊藿苷不低于0.50%)的樣品有:毫州、涪陵、恩施、周至、貴陽、杭州.其他地方收集的樣品淫羊藿苷的含量則低于藥典標(biāo)準(zhǔn).恩施、蘭州、西寧、巴盟和周至的淫羊藿藥材總黃酮含量也低于藥典標(biāo)準(zhǔn)(總黃酮不低于5.0%).這說明市場流通的淫羊藿藥材質(zhì)量差異顯著.各地淫羊藿藥材的來源各異，有些地方基本上來自地方農(nóng)民采集，物種混雜，含量不一，這些可能導(dǎo)致藥材質(zhì)量差異.

3.1 藥典規(guī)定的5個(gè)種藥材主要成分差異顯著

如表3所示，在這5個(gè)物種中，朝藿定C含量均最高，其中以巫山淫羊藿總黃酮含量最高.而藥典規(guī)定的淫羊藿苷的含量在5個(gè)物種中均較低，且差異較大，其中巫山淫羊藿的淫羊藿苷含量顯著高于其他4個(gè)物種.朝藿定C是淫羊藿種最豐富的活性成分之一，同樣具有重要的藥理活性［8］，本研究中朝藿定C在淫羊藿藥材中的含量最高，因此在種植資源選育研究中，應(yīng)該重點(diǎn)考慮朝藿定C的含量標(biāo)準(zhǔn).5個(gè)物種的主要成分含量差異顯著，說明淫羊藿藥材質(zhì)量提高有很大的潛力，種質(zhì)篩選和藥材進(jìn)一步標(biāo)準(zhǔn)化研究非常必要.

3.3 巫山淫羊藿不同地點(diǎn)的植株主要黃酮組成及含量差異顯著

采自湖北巴東、湖北大峽谷、湖北望城坡、湖北建始縣、湖北宣恩縣、湖南龍山縣、重慶巫山縣、湖北神農(nóng)架木魚鎮(zhèn)等地點(diǎn)的巫山淫羊藿4種主要黃酮的組成和含量以及總黃酮含量存在顯著的差異，如圖1和表4所示.

表2 部分地區(qū)市場流通淫羊藿藥材的主要活性成分含量Tab.2 Contents of the main active components of Epimedium drugs from different markets

表3 藥典五個(gè)種藥材的主要成分含量Tab.3 Contents of the main active components of five species stated by China pharmacopoeia

圖1 巫山淫羊藿不同個(gè)體中四種主要成分典型差異(1－朝藿定A;2－朝藿定B;3－朝藿定C;4－淫羊藿苷)Fig.1 Chromatogram map of Icariin and Epimedin A，B，and C from different plants of Epimedium wushanense

巫山淫羊藿不同地點(diǎn)的樣品主要成分含量差異極顯著，淫羊藿苷0% ～1.53%，4種黃酮總量 1.47% ～5.48%，總黃酮3.56% ～8.25%.而且不同植株的4種成分組成也存在典型的差異，表現(xiàn)為在某些植株中無法檢出.

這表明種內(nèi)存在著與主要活性成分相關(guān)的的遺傳變異.因此在種內(nèi)全面調(diào)查和采集資源，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行同園栽培以篩選優(yōu)良種質(zhì)，再在獲得優(yōu)良種質(zhì)的基礎(chǔ)上進(jìn)行輻射誘變、化學(xué)誘變、雜交等方法進(jìn)行育種，可望獲得高含量、穩(wěn)定的新品系，進(jìn)而推廣，實(shí)現(xiàn)淫羊藿藥材的品種標(biāo)準(zhǔn)化和質(zhì)量可控化.沒有品種標(biāo)準(zhǔn)化和藥材標(biāo)準(zhǔn)化，就不會(huì)有中藥材現(xiàn)代化.

表4 不同地點(diǎn)巫山淫羊藿的4種主要黃酮含量差異Tab.4 Contents of the main active components of Epimedium wushanense from different locations

4 結(jié)論

1)目前淫羊藿藥材來源仍舊停留于利用野生藥材，導(dǎo)致來源不清，含量不穩(wěn)，給藥材的療效和中藥企業(yè)帶來很大的影響.中藥現(xiàn)代化要求大量的標(biāo)準(zhǔn)化原藥材供應(yīng)，因此，人工干預(yù)的品種標(biāo)準(zhǔn)化藥材資源生產(chǎn)是必由之路，是中藥材質(zhì)量管理規(guī)范的基礎(chǔ)工作.盡管有些企業(yè)在開始嘗試建立淫羊藿GAP基地，對(duì)于推進(jìn)淫羊藿藥材質(zhì)量穩(wěn)定有重要意義，然而，缺乏種質(zhì)資源研究基礎(chǔ)以及相應(yīng)的優(yōu)質(zhì)穩(wěn)定的品種，藥材質(zhì)量難以有質(zhì)的提高.

2)研究證明，在淫羊藿屬內(nèi)五個(gè)物種的淫羊藿苷等黃酮類化合物相關(guān)的遺傳背景存在極顯著的差異，這為淫羊藿優(yōu)良種質(zhì)的培育提供了很大的空間，也表明了淫羊藿屬物種的資源普查的必要性.我國在上世紀(jì)60年代進(jìn)行了甾體化合物植物資源普查并篩選出皂素含量最豐富的物種—盾葉薯蕷(Dioscorea zingiberensis C.H.Wright)，從而引起了我國皂素產(chǎn)業(yè)的蓬勃發(fā)展，這就是中藥材種質(zhì)資源研究的一個(gè)典型例子.

3)隨著中藥產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展，靠野生資源供應(yīng)已經(jīng)不可能持續(xù)發(fā)展，人工干預(yù)的野生護(hù)育和大規(guī)模種植是必然趨勢.培育優(yōu)良品種可從源頭上解決中藥材的質(zhì)量控制問題.借鑒農(nóng)林作物的模式走中藥材品種標(biāo)準(zhǔn)化和種植標(biāo)準(zhǔn)化(GAP)是我國中藥產(chǎn)業(yè)的必經(jīng)之路.基于此，相應(yīng)藥材原植物的遺傳資源調(diào)查研究就顯得更加重要.篩選出優(yōu)良的種質(zhì)，就有了育種的物質(zhì)基礎(chǔ).本文以淫羊藿為個(gè)案，對(duì)藥典規(guī)定的藥材進(jìn)行比較研究，籍以為藥典信息更正、中藥標(biāo)準(zhǔn)化的基礎(chǔ)研究的重要性提供一個(gè)佐證，以及對(duì)其他中藥材資源的現(xiàn)代化研究提供一個(gè)借鑒.

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