在線柱切換反相高效液相色譜法測(cè)定大鼠血漿丁螺環(huán)酮濃度及藥代動(dòng)力學(xué)研究

張曉惠，王 榮，謝 華，尹 強(qiáng)，李曉云，賈正平，張娟紅，李文斌

丁螺環(huán)酮是一種非苯二氮艸卓類抗焦慮藥物，能夠治療高原環(huán)境下產(chǎn)生的焦慮、煩躁等癥狀，具有療效好，不良反應(yīng)少，無耐受性和依賴性等優(yōu)點(diǎn)，缺點(diǎn)是首關(guān)效應(yīng)明顯，生物利用度低，因此，對(duì)其藥代動(dòng)力學(xué)的研究有助于指導(dǎo)臨床合理用藥［1］，也為高原環(huán)境中應(yīng)用鹽酸丁螺環(huán)酮提供一定的藥代動(dòng)力學(xué)依據(jù)。目前對(duì)血樣中丁螺環(huán)酮的檢測(cè)方法主要有氣相色譜－質(zhì)譜法、液相色譜－質(zhì)譜法、高效液相色譜法，但血樣的前處理方法均為離線處理，存在操作繁瑣、成本高、選擇性低等缺點(diǎn)［2-6］。柱切換技術(shù)可實(shí)現(xiàn)樣品的在線預(yù)處理，能克服傳統(tǒng)離線處理方法的缺點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)利用實(shí)驗(yàn)室自制的限進(jìn)性填料柱對(duì)大鼠血漿樣品進(jìn)行在線預(yù)處理，使丁螺環(huán)酮在預(yù)處理柱上保留并除去蛋白等大分子雜質(zhì)，實(shí)現(xiàn)血樣的直接進(jìn)樣分析，具有簡(jiǎn)便、快速、靈敏、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，適合生物樣品中丁螺環(huán)酮的藥代動(dòng)力學(xué)研究。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 柱切換－反相高效液相色譜系統(tǒng):2個(gè)LC-6A泵、SPD-6AV紫外檢測(cè)器、CTO-6A柱溫箱(日本島津公司);7725i進(jìn)樣閥(美國(guó)Rheodyne公司);7000型切換閥(美國(guó)Rheodyne公司);色譜信號(hào)由SCL-6A控制器(日本島津公司)控制;超聲波清洗器(天津奧特賽恩思儀器有限公司);TGL-16B型離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);AE-240型電子天平(上海梅特勒－托利多)。

1.2 試藥 甲醇為分析純?cè)噭?四川西隴化工有限公司，批號(hào):120319)，水為滅菌注射用水(西安雙鶴制藥有限公司，批號(hào):110128112)，丁螺環(huán)酮對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào):101059-201101)，丁螺環(huán)酮片(北大國(guó)際醫(yī)院集團(tuán)西南合成制藥股份有限公司，批號(hào):H19990302)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 色譜條件 預(yù)處理柱為內(nèi)表面反相限進(jìn)性填料柱(45.0 mm ×4．6 mm，5.0 μm;實(shí)驗(yàn)室自制)，預(yù)處理流動(dòng)相:水 －甲醇(95∶5，V/V)，流速:1 ml/min。分析柱為(Luna C18，250.0mm ×4．6 mm，5.0 μm;美國(guó) phenomenex 公司)，分析流動(dòng)相:甲醇－5 mmol/L甲酸銨(75∶25，V/V)，流速:1 ml/min。進(jìn)樣量:20 μl;柱溫:25℃;檢測(cè)波長(zhǎng):283 nm。

2.2 溶液的制備

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液:精密稱量0．01 g鹽酸丁螺環(huán)酮對(duì)照品于10 ml的量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，配成1 mg/ml的丁螺環(huán)酮儲(chǔ)備液，置 4℃下保存。

2.2.2 內(nèi)標(biāo)溶液:精密稱取0．001 g非洛地平標(biāo)準(zhǔn)品于10 ml的量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，配成0．1 mg/ml的非洛地平標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.3 血漿樣品預(yù)處理 取SPF級(jí)雄性Wistar大鼠(由中國(guó)上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，動(dòng)物合格證號(hào):200700524909)血漿樣品1 ml，置于2 ml具塞離心試管中，于5000 r/min速率下離心5 min，精密吸取上清液置于另一離心試管中，在－20℃下冷凍保存。測(cè)定樣品時(shí)，在室溫下融解，吸取 0．1 ml上清液，加 5 μl 0．1 mg/ml的非洛地平標(biāo)準(zhǔn)溶液。直接進(jìn)樣20 μl。

2.4 實(shí)驗(yàn)過程 進(jìn)樣時(shí)，切換閥如圖1A連接，預(yù)處理柱與分析柱呈并聯(lián)狀態(tài)，因此，進(jìn)樣后，樣品先進(jìn)入預(yù)處理柱，待3 min后，血漿中的大分子蛋白等雜質(zhì)隨預(yù)處理流動(dòng)相沖出，而丁螺環(huán)酮及其他小分子物質(zhì)被保留在預(yù)處理柱上，此時(shí)，進(jìn)行切換，使切換閥如圖1B連接，預(yù)處理柱與分析柱呈串聯(lián)狀態(tài)，分析流動(dòng)相將保留在預(yù)處理柱上的丁螺環(huán)酮及其他小分子物質(zhì)洗脫至分析柱進(jìn)行分離分析。分析完畢后，將閥切換至初始狀態(tài)，使預(yù)處理流動(dòng)相和分析流動(dòng)相分別平衡預(yù)處理柱和分析柱5 min，以便下次進(jìn)樣。

3 結(jié)果

3.1 方法專屬性 在上述柱切換－反相高效液相色譜條件下對(duì)空白血漿、空白血漿加對(duì)照品及大鼠血漿樣品的色譜圖進(jìn)行比較，丁螺環(huán)酮的出峰時(shí)間為 9．6 min，內(nèi)標(biāo)出峰時(shí)間為 13．0 min，波長(zhǎng)為283 nm時(shí)，丁螺環(huán)酮與內(nèi)標(biāo)峰完全分離，互不干擾，峰形良好，見圖2。

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取空白血漿，加丁螺環(huán)酮儲(chǔ)備液及內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，配成丁螺環(huán)酮質(zhì)量濃度分別為0．2、0．3、0．6、1．2、2．4、4．8 μg/ml的系列血漿標(biāo)準(zhǔn)樣品，按“2．3”項(xiàng)下方法處理后，精密吸取 20 μl進(jìn)樣，在優(yōu)化的色譜條件下進(jìn)行分離，測(cè)定峰面積。以峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值(As/Ai)為縱坐標(biāo)(Y)，以丁螺環(huán)酮的質(zhì)量濃度(μg/ml)為橫坐標(biāo)(X)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程為Y=0．2219 X+0．0004(r=0．9993)，結(jié)果表明:血漿中的丁螺環(huán)酮在0．2～4．8 μg/ml的濃度范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

圖1 柱切換－反相高效液相色譜系統(tǒng)示意圖

圖2 空白血漿、空白血漿加對(duì)照品及大鼠血漿樣品高效液相色譜圖

3.3 精密度及回收率 按照“3．2”項(xiàng)下方法配制質(zhì)量濃度分別為 0．3、0．6、2．4 μg/ml的丁螺環(huán)酮標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品，按“2．3”項(xiàng)下方法處理后，采用柱切換－反相高效液相色譜法測(cè)定，1 d內(nèi)測(cè)定6次，連續(xù)測(cè)定3 d，計(jì)算日內(nèi)及日間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，RSD 為 0．07%～3．54%，說明本方法精密度較好?；厥章蕦?shí)驗(yàn)中，分別考查了3個(gè)加標(biāo)水平0．3、0．6、2．4 μg/ml的丁螺環(huán)酮的血漿樣品，處理方法同上，每個(gè)水平連續(xù)測(cè)5次，計(jì)算平均回收率，結(jié)果顯示符合生物樣品測(cè)定方法的要求，見表1。

表1 3個(gè)濃度丁螺環(huán)酮的精密度和平均回收率

3.4 穩(wěn)定性

3.4.1 常溫放置穩(wěn)定性:配制質(zhì)量濃度分別為0.3、0.6、2.4 μg/ml的丁螺環(huán)酮血漿標(biāo)準(zhǔn)樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法處理后，于室溫下放置 0、2、4、8、12、24 h，結(jié)果3個(gè)濃度的血漿標(biāo)準(zhǔn)樣品RSD分別為2.00% 、1.05%、1.96% 。

3.4.2 反復(fù)凍融穩(wěn)定性:配制質(zhì)量濃度為0.6 μg/ml的丁螺環(huán)酮標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品，按“2．3”項(xiàng)下方法處理后，在 －20℃下反復(fù)凍融72 h，RSD為1．87%。

3.5 樣品的測(cè)定 隨機(jī)選取Wistar大鼠6只，體重200～220 g，自由飲水，禁食12 h后，按15 mg/kg劑量給予丁螺環(huán)酮片劑灌胃，并于給藥后0．08、0．25、0．5、0．75、1、1．5、2、4、6、8、12、24 h 經(jīng)大鼠眼球后靜脈叢采血0．5 ml，置于肝素化試管中，在5000 r/min的速率下離心5 min，取上清液于－40℃冷凍保存，采用本實(shí)驗(yàn)建立的柱切換－反相高效液相色譜法測(cè)定大鼠體內(nèi)丁螺環(huán)酮的血藥濃度并繪制平均血藥濃度－時(shí)間曲線(圖3)，采用藥物動(dòng)力學(xué)處理軟件DAS 2．0程序?qū)Χ÷莪h(huán)酮的血藥濃度－時(shí)間曲線進(jìn)行擬合，求算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。其血藥濃度－時(shí)間曲線面積 AUC0→8為 3．023 μg/(ml·h)，AUC0→∞為4．056 μg/(ml·h)，半衰期(t1/2)為3．944 h，最大濃度 (Cmax)為 1．38(μg/ml)，清 除 率 (CLZ)為3．712 L/(h·kg)。

圖3 丁螺環(huán)酮在大鼠體內(nèi)的平均血藥濃度－時(shí)間曲線

4 討論

柱切換技術(shù)是通過改變進(jìn)樣閥與色譜柱、檢測(cè)器之間的連接關(guān)系，通過改變流動(dòng)相的走向或流動(dòng)相系統(tǒng)，達(dá)到樣品的凈化、富集和分離等目的。目前已有單柱單泵、單泵雙柱、雙柱雙泵及多柱多泵等模式，還可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要自行設(shè)計(jì)［7-8］。本文采用雙泵雙柱模式，由2個(gè)泵、1個(gè)進(jìn)樣閥、1個(gè)切換閥、限進(jìn)性填料柱及分析柱組成。限進(jìn)性填料是一種新的樣品前處理技術(shù)，其中的內(nèi)表面反相限進(jìn)性填料應(yīng)用較多，該填料是在硅膠表面鍵合一層親水層，能夠限制蛋白質(zhì)的吸附，內(nèi)表面具有疏水性，小分子物質(zhì)可進(jìn)入內(nèi)孔與內(nèi)表面的疏水基團(tuán)相互作用而被保留，而大分子物質(zhì)則不能滲透進(jìn)入，因此，在死體積或接近死體積時(shí)大分子物質(zhì)被洗脫下來，而不會(huì)引起蛋白在色譜柱上沉淀或不可逆吸附而造成色譜柱柱壓升高及毀壞［9-13］。

限進(jìn)性填料柱能夠通過柱切換技術(shù)實(shí)現(xiàn)生物樣品的在線除蛋白過程，其中切換時(shí)間是影響除蛋白的一個(gè)關(guān)鍵因素，切換時(shí)間過早，血漿中的蛋白還沒有被完全除去，會(huì)引起蛋白在色譜柱上沉淀或不可逆吸附而造成色譜柱柱壓升高或毀壞;切換過晚，會(huì)造成色譜峰展寬，分析時(shí)間延長(zhǎng)，因此，切換時(shí)間的選擇以蛋白質(zhì)完全被洗脫的時(shí)間為最佳。本實(shí)驗(yàn)將預(yù)處理柱與檢測(cè)器連接，在波長(zhǎng)為280 nm下進(jìn)空白血漿，結(jié)果表明:3 min內(nèi)血漿中的蛋白質(zhì)基本能被完全洗脫，因此，選擇3 min為切換時(shí)間。

本文將限進(jìn)性填料柱與柱切換技術(shù)相結(jié)合，建立了一種快速在線檢測(cè)大鼠血漿中丁螺環(huán)酮濃度的方法，該方法可實(shí)現(xiàn)樣品的直接進(jìn)樣，有效縮短了分析時(shí)間，減少血漿樣品用量，降低血漿樣品離線處理過程中的誤差，具有較好的線性關(guān)系、精密度及回收率，操作簡(jiǎn)便，特異性好，適合生物樣品中丁螺環(huán)酮的藥代動(dòng)力學(xué)研究，為丁螺環(huán)酮的高原藥代動(dòng)力學(xué)研究提供了一種新方法和依據(jù)。

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