丙谷二肽對γ射線致小鼠肺組織損傷的防護作用*

任雪玲，湯 寧，白 麗，陳 斌，李瑩輝，趙玉芬

1)鄭州大學(xué)藥學(xué)院 鄭州 450001 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院感染科 鄭州 450052 3)航天醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)與應(yīng)用國家重點實驗室 北京 100094 4)鄭州大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院河南省磷化工工程研究中心 鄭州 450052

60Co－γ射線等電離輻射源是臨床上常用的放療用射線，可用于肺癌及其他胸部腫瘤的放射治療[1]。然而，γ射線盡管具有較強的病變細(xì)胞殺死效應(yīng)，但同時也會不可避免地引起機體正常組織和器官的損傷，不僅可對患者造成放射性損傷[2]，而且也會給受照醫(yī)護人員帶來一定程度的危害。因此如何減輕輻射損傷受到人們的日益關(guān)注。有研究[3]顯示，γ射線對肺組織和細(xì)胞的損傷主要是由于它可以促進活性氧自由基的生成，從而造成有機體生物分子斷裂、DNA 損傷。N(2)－L－丙氨酰－L－谷氨酰胺(丙谷二肽)是臨床上常用的一種營養(yǎng)藥物。據(jù)報道，丙谷二肽除可提高組織和細(xì)胞的免疫功能外[4]，還可以提高細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽的含量，從而有效清除過氧化物[5]。作者先對小鼠進行丙谷二肽灌胃給藥，然后再進行γ射線全身照射，觀察小鼠肺組織輻射損傷變化情況，并分析肺組織中Bcl－2和Bax蛋白表達的變化，探討丙谷二肽對肺組織輻射損傷的防護作用及可能的機制，為臨床放射防護藥物的開發(fā)應(yīng)用提供一定的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性昆明小鼠27只，體重(20±2)g，6～8周齡，由河南省實驗動物中心提供。丙谷二肽由廈門大學(xué)化學(xué)系提供。兔抗小鼠Bcl－2、Bax多克隆抗體購自Santa Cruz公司，β－actin鼠源單克隆抗體購自康成生物公司。Trizol、碘化丙啶(PI)、MTT等生化試劑購自創(chuàng)生科技有限公司。超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。RIPA裂解液購自北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司。FCC－8000型同心回轉(zhuǎn)式60Co治療機購自山東新華醫(yī)療器械股份有限公司，參數(shù)設(shè)定為源皮距80 cm，布野面積20 cm×20 cm，劑量1 Gy/min。

1.2 實驗分組 將27只小鼠隨機分為3組，分別為正常對照組、輻射組、丙谷二肽組，每組9只。丙谷二肽組灌胃給予丙谷二肽，給藥劑量1000 mg/kg，1次/d，連續(xù)7 d。第8天，輻射組、丙谷二肽組均給予4.0 Gy60Co γ射線照射，正常對照組不作處理。射線照射3 d后，將3組小鼠脫頸處死，收集有關(guān)臟器，進行相關(guān)指標(biāo)的測定。

1.3 外周血白細(xì)胞總數(shù)檢測 小鼠脫頸處死前摘眼球眼眶取血，加入體積分?jǐn)?shù)1%鹽酸，混勻后置于細(xì)胞計數(shù)板中進行白細(xì)胞計數(shù)，并按照以下公式換算成白細(xì)胞總數(shù)。白細(xì)胞總數(shù)(×109L－1)=細(xì)胞計數(shù)板中白細(xì)胞數(shù)÷4×稀釋倍數(shù)×107。

1.4 臟器指數(shù)測定 取脾臟、肺臟稱重，按照下列公式計算臟器指數(shù)。臟器指數(shù)=臟器重(mg)/體重(g)×100%。

1.5 肺組織學(xué)觀察和SOD活性測定 取出肺葉組織，生理鹽水清洗干凈后甲醛固定24 h，然后脫水、固定、切片、HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。分離小鼠肺臟，按照SOD試劑盒說明書操作，測定SOD活性。

1.6 肺組織細(xì)胞增殖和凋亡的檢測 ①將肺組織取出，剪碎并勻漿，200目濾網(wǎng)過濾得到單細(xì)胞懸液，過夜培養(yǎng)，加入MTT繼續(xù)培養(yǎng)4 h，加入二甲基亞砜溶解藍紫色結(jié)晶，測定570 nm波長處的吸光度(A)值。細(xì) 胞 增 殖 率 = [(A實驗組－ A空白)/(A正常對照組－A空白)]×100%。②將小鼠肺組織剪碎、勻漿濾網(wǎng)過濾后，PBS洗滌，用結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，加入 5 μL FITC AnnexinV 和 5 μL PI染料，混合均勻后室溫避光放置15 min，上流式細(xì)胞儀檢測，使用ModFit LT for Mac V3.0軟件分析細(xì)胞凋亡率。

1.7 肺組織中 Bcl-2和 Bax蛋白的檢測 采用Western blot法檢測。向肺組織中加入RIPA裂解液，冰浴條件下勻漿提取蛋白，BCA法進行蛋白定量，采用常規(guī)SDS－PAGE法進行垂直電泳、轉(zhuǎn)膜和封閉后，分別加入 Bcl－2一抗(稀釋1000倍)、Bax一抗(稀釋1000倍)或β－actin一抗(稀釋2000倍)4℃過夜孵育。TBST洗滌3次后加入二抗(稀釋5000倍)室溫孵育1 h。最后采用ECL化學(xué)發(fā)光法進行顯影、定影。用Quantity One圖像分析軟件分析條帶的光密度，以目的蛋白與β－actin條帶光密度的比值表示目的蛋白的相對表達量。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 10.0進行統(tǒng)計學(xué)分析。3組小鼠外周血白細(xì)胞總數(shù)、臟器指數(shù)、肺組織SOD活性、細(xì)胞凋亡率、Bcl－2和Bax蛋白表達水平的比較采用單因素方差分析和LSD－t檢驗，輻射組和丙谷二肽組細(xì)胞增殖率和Bcl－2/Bax比值的比較采用兩獨立樣本t檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 組織學(xué)觀察 見圖1。正常對照組小鼠肺組織形態(tài)自然，間質(zhì)少;輻射組小鼠肺組織出現(xiàn)異常，毛細(xì)血管通透性增加，血管內(nèi)細(xì)胞滲出進入肺間質(zhì)，肺泡壁增厚;丙谷二肽組小鼠肺組織學(xué)變化較輻射組有所減輕。

圖1 3組小鼠肺組織學(xué)表現(xiàn)(HE，×400)

2.2 3組小鼠外周血白血細(xì)胞總數(shù)、臟器指數(shù)、肺組織SOD活性的比較 見表1。由表1可知，與正常對照組相比，輻射組小鼠外周血白細(xì)胞總數(shù)、脾臟指數(shù)下降，肺臟指數(shù)升高，肺組織SOD活性降低。與輻射組比較，丙谷二肽組小鼠肺臟指數(shù)下降，肺組織SOD活性升高。

表1 3組小鼠白細(xì)胞總數(shù)、臟器指數(shù)和肺組織SOD活性的比較

2.3 3組小鼠肺組織細(xì)胞增殖率和凋亡率的比較丙谷二肽組細(xì)胞增殖率為(78.88±3.87)%，較輻射組的(57.25 ±11.63)% 提高(t=5.294，P ＜0.001);細(xì)胞凋亡率亦較輻射組降低，見表2。

2.4 3組小鼠肺組織中Bcl-2和Bax蛋白表達的比較 見圖2、表2。

圖2 3組小鼠肺組織中Bcl-2和Bax蛋白的表達

表2 3組小鼠肺組織中細(xì)胞凋亡率、Bcl-2和Bax蛋白表達的比較

3 討論

胸部惡性腫瘤在進行放射性治療時，非常容易導(dǎo)致放射性肺損傷，臨床表現(xiàn)主要有肺充血，肺泡纖維蛋白滲出增多，甚至出現(xiàn)肺間質(zhì)纖維化[6]。已有研究[7]表明，氧自由基的大量生成是放射性損傷的主要機制。SOD是一類廣泛存在于機體各種組織細(xì)胞內(nèi)的金屬酶，主要用于清除超氧陰離子自由基;在輻射損傷的肺組織中，SOD活性與氧自由基水平呈負(fù)相關(guān)[8]。該研究中，輻射組小鼠肺組織呈放射性損傷改變，同時外周血白細(xì)胞總數(shù)、脾臟指數(shù)顯著下降，肺臟指數(shù)升高，肺組織SOD活性降低，說明該組小鼠存在放射性肺損傷。與輻射組小鼠比較，丙谷二肽組小鼠放射性肺損傷改變減輕，同時肺臟指數(shù)下降，肺組織SOD活性升高，提示丙谷二肽對γ射線照射導(dǎo)致的肺組織損傷確實有一定的防護作用。

氧自由基可以通過多種途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[9－10]，從而對機體造成損傷。細(xì)胞凋亡的調(diào)控與兩類基因直接相關(guān)，分別是促凋亡基因和抑制凋亡基因，其中最具代表性的分別是 bcl－2 和 bax[11]，其表達產(chǎn)物Bax和Bcl－2蛋白可以形成同源或異源二聚體，在細(xì)胞凋亡的調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用，因此有研究[12－13]稱 Bcl－2/Bax 比值是調(diào)控細(xì)胞凋亡的“分子開關(guān)”。該研究中，輻射組小鼠肺組織細(xì)胞凋亡率較正常對照組顯著升高，同時肺組織中Bcl－2蛋白的表達降低，而Bax蛋白表達升高，說明γ射線照射誘導(dǎo)了肺組織Bax和Bcl－2蛋白表達水平的改變，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的增加。與輻射組比較，丙谷二肽組小鼠肺組織細(xì)胞增殖率顯著提高，而凋亡率降低，小鼠肺組織中Bcl－2蛋白表達升高，Bax蛋白表達降低，Bcl－2/Bax比值升高。這表明丙谷二肽有可能通過Bcl－2信號通路介導(dǎo)調(diào)控肺組織的細(xì)胞凋亡，從而實現(xiàn)對輻射致肺損傷小鼠肺組織的防護。但是，輻射損傷及其防護機制是一個涉及多基因、多通路的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，確切的機制還有待于進一步的深入研究。

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