大孔吸附樹(shù)脂純化油茶殼中多酚類化合物的研究

李嘉偉，邢 鵬，張迎嫻，陸 英,2

（1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙410128；2. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙410128）

油茶屬山茶科山茶屬植物，為多年生喬木或灌木，在我國(guó)廣泛分布于湖南、江西、廣西等地區(qū)。近年來(lái)，湖南油茶業(yè)出現(xiàn)前所未有的發(fā)展趨勢(shì)，油茶林面積達(dá)到126 萬(wàn)hm2，年產(chǎn)油茶12.1 萬(wàn)t，年產(chǎn)值達(dá)到72.66 億元，居全國(guó)首位。油茶殼就是油茶果實(shí)的外殼，在傳統(tǒng)的茶油制作過(guò)程中，大部分茶籽榨油之后，將油茶殼丟棄，造成珍貴資源的嚴(yán)重浪費(fèi)。

植物多酚類化合物具有多種生理活性，植物多酚已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、食品、制革和日用化工等相關(guān)領(lǐng)域，并發(fā)揮著不可替代的作用，具有廣闊的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。目前人們對(duì)油茶籽殼的開(kāi)發(fā)利用主要集中在其茶皂素的研究[1]，對(duì)其中的多酚類化學(xué)成分報(bào)導(dǎo)較少[2]，筆者通過(guò)對(duì)油茶殼中多酚類化合物提取分離純化工藝，獲得高含量的油茶殼中多酚類化合物[3]，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 FZ-102 微型植物粉碎機(jī)(天津泰斯特儀器有限公司）；UV-2100 型紫外分光光度計(jì)（北京萊伯泰科儀器有限公司）；SK3300LH 超聲波清洗器(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；HY-4 調(diào)速振蕩儀（江蘇金壇中大儀器廠）；RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠）。

1.1.2 材料與試劑 材料：油茶殼（懷化市洪源農(nóng)林開(kāi)發(fā)有限公司，干燥品）；試劑：沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，純度98%）、鎢酸鈉、鉬酸鈉、Na2CO3溶液、溴水、磷酸、鹽酸、硫酸鋰。

1.2 油茶殼中多酚含量的檢測(cè)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 準(zhǔn)確稱取110.0 mg 含水9.2%的沒(méi)食子酸，溶解并用蒸餾水定容至100 mL，此溶液沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度為1 mg/mL。

分別稱取1 mg/mL 的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、7.0、9.0、11.0 mL 至100 mL 容量瓶中，定容，溶液質(zhì)量濃度為0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.07、0.09、0.11 mg/mL。

分別吸取以上各濃度的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)使用液各1.0 mL，分別加5.0 mL 水、1.0 mL 鎢酸鈉-鉬酸鈉混合溶液和3.0 mL（75g/L）碳酸鈉溶液，混勻，顯色，室溫下放置2 h，以標(biāo)準(zhǔn)曲線的“0”管為空白，在765 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，以沒(méi)食子酸質(zhì)量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 樣品含量的檢測(cè) 取1 克油茶殼樣品，按料液比1:200 提取3 次。合并提取液，取1 mL，分別加5.0 mL水、1.0 mL 鎢酸鈉-鉬酸鈉混合溶液和3.0 mL（75g/L）碳酸鈉溶液，混勻，顯色，放置2 h，以標(biāo)準(zhǔn)曲線的“0”管為空白，在765 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算油茶殼樣品中多酚的含量。

1.3 油茶殼多酚的提取工藝參數(shù)

1.3.1 工藝參數(shù)的確定 根據(jù)工業(yè)化生產(chǎn)的常規(guī)提取方法，提取次數(shù)通常為2 次，主要影響多酚提取率的其他4個(gè)因素分別為溫度、時(shí)間、料液比和乙醇濃度。因此分別設(shè)溫度（A）、時(shí)間（B）、料液比（C）、乙醇濃度（D）這4個(gè)因素，每個(gè)因素設(shè)3個(gè)水平（見(jiàn)表1），根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)，確定提取油茶殼中多酚含量的最佳工藝。

表1 油茶殼多酚提取因素與水平設(shè)計(jì)表

1.4 大孔吸附樹(shù)脂純化工藝的研究

1.4.1 吸附樹(shù)脂的預(yù)處理和再生 樹(shù)脂的預(yù)處理：大孔吸附樹(shù)脂先用95%乙醇充分浸泡24 h，濕法裝柱，繼續(xù)用95%乙醇在柱上流動(dòng)洗脫，不時(shí)檢查流出液直至流出液與蒸餾水混合（體積比為1∶5）不呈白色混濁為止，然后用蒸餾水洗滌至無(wú)醇味，備用。

樹(shù)脂再生：用5%的檸檬酸溶液洗滌樹(shù)脂，至流出液呈無(wú)色，再用3%的NaOH 溶液洗滌樹(shù)脂，至流出液無(wú)色，最后用蒸餾水洗至中性，即可進(jìn)行下一周期的使用。1.4.2 樹(shù)脂的篩選 將預(yù)處理好的6種大孔吸附樹(shù)脂（ADS-21、AB-8、NKA-2、NKA-9、D-101、聚酰胺）去表面水后，各精密量取1.0g，放置于具塞磨口錐形瓶中，分別加入100 mL 溶度一定的油茶殼多酚原料液，在搖床中振蕩24 h，過(guò)濾，測(cè)定濾液中多酚濃度。吸附飽和的樹(shù)脂再各用100 mL 70%乙醇解吸24 h，待解吸完全后，測(cè)定解吸液中多酚濃度，按下列計(jì)算公式分別計(jì)算樹(shù)脂的吸附量和解吸率（樹(shù)脂吸附量以單位質(zhì)量濕樹(shù)脂吸附的多酚量表示）。

根據(jù)公式計(jì)算獲得各種樹(shù)脂的吸附量和解吸率，通過(guò)比較，確定分離油茶殼多酚的最佳樹(shù)脂類型。

1.4.3 樹(shù)脂靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué) 將提取原液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無(wú)醇味，制得水溶液。取50 mL 待測(cè)水溶液，加入到1g 預(yù)處理好的最佳樹(shù)脂中，在搖床中震蕩吸附，于不同的時(shí)間測(cè)定溶液中多酚濃度。計(jì)算不同時(shí)間的吸附量，繪制吸附量-時(shí)間變化曲線。

1.4.4 大孔吸附樹(shù)脂上樣條件的選擇 （1）pH 值對(duì)吸附量的影響：將提取原液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無(wú)醇味，得到多酚水溶液，測(cè)定其溶度及pH 值。取6 份各50 mL，用6 mol/L 鹽酸分別調(diào)節(jié)pH 值為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0，7.0，然后加入到一系列1.0 g 已去表面水的最佳樹(shù)脂中，在搖床中震蕩吸附24 h，測(cè)定吸附后溶液中多酚含量，并計(jì)算出樹(shù)脂的吸附量，根據(jù)樹(shù)脂吸附量的大小綜合考慮選擇最佳pH。（2）料液濃度對(duì)吸附量的影響：取待測(cè)水溶液分成5 份，每份100 mL，分別加蒸餾水稀釋至100、150、200、250、300 mL 將料液稀釋，同時(shí)將pH 調(diào)到最佳，用50 mL 的最佳樹(shù)脂以最佳流速進(jìn)行動(dòng)態(tài)實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)流出液中的多酚含量，計(jì)算樹(shù)脂對(duì)多酚的吸附量，根據(jù)吸附量的大小綜合考慮選擇最佳料液濃度。（3）上柱流速對(duì)吸附的影響：取最佳多酚濃度的原料液5 份，同時(shí)將pH 調(diào)節(jié)至最佳，每份100 mL，分別按2、3、4、5、6 BV/h 的流速通過(guò)裝柱體積為50 mL 的樹(shù)脂柱，檢測(cè)流出液中的多酚含量，計(jì)算樹(shù)脂的吸附量，根據(jù)樹(shù)脂吸附量的大小綜合考慮選擇最佳上柱流速。（4）泄漏曲線確定上樣體積：按上述所確定的吸附條件，取最佳pH 值，最佳質(zhì)量濃度的油茶殼稀釋液以最佳的流速通過(guò)裝柱體積為50 mL 的最佳樹(shù)脂柱，分步收集流出液，對(duì)流出液進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定每份流出液的吸光度值，計(jì)算樹(shù)脂對(duì)多酚的吸附量，繪制泄漏曲線，確定最佳上柱體積。

1.4.5 解吸劑的選擇 分別取250 ml 最佳多酚含量的原料液以最佳的流速通過(guò)裝柱體積為50 mL 的樹(shù)脂柱5 份，吸附完全后，先用100 mL 的去離子水，再用300 mL不同濃度（40%、50%、60%、70%、80%）的乙醇溶液分別洗脫，收集不同乙醇濃度的洗脫液，檢測(cè)5 份洗脫液中多酚含量，計(jì)算各種洗脫劑的洗脫率，選擇最佳解吸劑。1.4.6 洗脫流速的確定 取5 份各250 mL 最佳多酚濃度的原料液（pH 值最佳），以最佳的流速通過(guò)50 mL 的樹(shù)脂柱，吸附后，先用100 mL 的去離子水洗至流出液無(wú)色，再用200 mL 的80%乙醇溶液分別以2、3、4、5、6 BV/h 的流速進(jìn)行洗脫，測(cè)定洗脫液中多酚含量，計(jì)算不同流速下的洗脫率，根據(jù)洗脫率的大小選擇最佳洗脫流速。

1.4.7 洗脫曲線確定洗脫體積 按上述所確定的吸附、洗脫條件，取油茶殼稀釋液250 mL（最佳多酚濃度，最佳pH 值）通過(guò)50 mL 樹(shù)脂柱進(jìn)行吸附。吸附后用水洗至流出液無(wú)色，再用80%乙醇洗脫，50 mL 為一流分收集洗脫液，測(cè)定各洗脫液中的多酚含量，制作洗脫曲線，確定最佳洗脫體積。

1.4.8 工藝擴(kuò)大及樣品純度的檢測(cè) 按上述確定的工藝條件工藝擴(kuò)大，進(jìn)行2 次重復(fù)試驗(yàn)，洗脫液濃縮后冷凍干燥，得到棕色產(chǎn)品，取適量樣品用蒸餾水溶解，按2.2 中方法檢測(cè)樣品中多酚含量，測(cè)定樣品純度及提取率。公式如下所示：

2 結(jié)果與討論

2.1 沒(méi)食子酸多酚檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)2.2.5 中的方法測(cè)得各組對(duì)照品的吸光度值，以其為縱坐標(biāo)，以對(duì)照品的質(zhì)量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1，得線性回歸方程y=0.006 8 x－0.069 5，R2=0.996。結(jié)果表明所測(cè)吸光度值在0.05～0.50 時(shí)，其沒(méi)食子酸含量與吸光度值呈良好的線性關(guān)系。

圖1 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 提取工藝正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表2）表明，影響提取油茶殼中多酚的主要因素依次為溶劑濃度（D）>提取溫度（A）>提取時(shí)間（B）>料液比（C），以上4個(gè)因素均沒(méi)有達(dá)到顯著的要求，因此最佳組合為：A3B3C3D1。但是B2 和C2 的結(jié)果與B3 和C3 的結(jié)果相差不大，出于工業(yè)化考慮，提取的時(shí)間短，料液比低能夠有效地降低生產(chǎn)成本，因此選用較佳工藝條件為A3B2C2D1。

表2 油茶殼中多酚正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

即較佳條件：提取溫度為90℃，提取時(shí)間為60 min，提取料液比為1∶15，乙醇濃度為40%。

2.2.2 樣品含量的檢測(cè) 根據(jù)油茶殼中多酚含量的檢測(cè)方法，測(cè)得油茶殼中多酚含量為12.05%。

2.3 大孔吸附樹(shù)脂純化工藝

2.3.1 樹(shù)脂的篩選 實(shí)驗(yàn)選用的6種不同的樹(shù)脂都被廣泛應(yīng)用于不同植物多酚的分離純化。對(duì)油茶殼多酚的吸附及解吸結(jié)果見(jiàn)表3。分析表3 中的數(shù)據(jù)，吸附量最大的是AB-8，達(dá)到了63.25 mg/g，其次是ADS-21 的吸附量有51.08 mg/g，但是解吸率最大的是ADS-21，解吸率是56.36%，AB-8 次之，解吸率有49.79%。雖然綜合能力比較平均，但是出于經(jīng)濟(jì)考慮，AB-8 的價(jià)格比ADS-21低廉，因此后續(xù)工藝最佳樹(shù)脂選定為AB-8。

表3 6種大孔吸附樹(shù)脂的吸附量與解吸率

2.3.2 靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)分析 由圖2 可知，樹(shù)脂對(duì)油茶殼多酚的吸附量，2～6 h 之間呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，24 h 吸附量達(dá)到較高水平。但由于工業(yè)化生產(chǎn)中，樹(shù)脂的吸附時(shí)間24 h 不符合生產(chǎn)效率，因此在合理的時(shí)間范圍內(nèi)，應(yīng)選擇吸附時(shí)間為4 h 較為合適。

圖2 靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線

2.3.3 大孔吸附樹(shù)脂上樣條件的選擇

（1）原料液pH 值對(duì)吸附量的影響。原料液不同pH 值對(duì)樹(shù)脂吸附量的影響見(jiàn)圖3。油茶殼原料液的pH值測(cè)得為3.7。從圖3 中可看出，當(dāng)原料液pH 值在3-4時(shí)，樹(shù)脂的吸附量比較大。

圖3 料液pH 值對(duì)吸附量的影響

天然多酚類多有酚羥基取代，故顯酸性，根據(jù)大孔吸附樹(shù)脂吸附原理，吸附過(guò)程中吸附介質(zhì)以分子狀態(tài)被吸附，因此要達(dá)到較好的效果必須使吸附質(zhì)保持分子狀態(tài)。一般情況下，酸性化合物在適當(dāng)酸性溶液中充分吸附，但是酸度過(guò)大可能導(dǎo)致化合物結(jié)構(gòu)變化，酸性不宜太強(qiáng)，而料液在pH 值為3.7（即本身pH 值）時(shí)的吸附量也比較大，因此，原料液在上柱前應(yīng)保持pH 值在3.7 左右。

（2）料液濃度對(duì)吸附量的影響。不同多酚濃度的料液對(duì)吸附量的影響見(jiàn)圖4。不同初始濃度的上樣液，樹(shù)脂的泄露曲線不同，樹(shù)脂吸附量也不相同，濃縮后的原料液濃度測(cè)定為9.45 mg/mL，根據(jù)稀釋比例設(shè)定梯度，各取5 份100 mL 原料溶液，由圖3 可以看出，隨著料液濃度的減少，樹(shù)脂的吸附量增多，在稀釋到250 mL（濃度為3.78 mg/mL）及300 mL（濃度為3.15 mg/mL）左右時(shí)吸附量差不多，效果較好，但出于工業(yè)化的考慮，濃度高能降低稀釋成本，因此，選擇最佳上樣濃度為3.78 mg/mL。

圖4 料液濃度對(duì)吸附量的影響

（3）上柱流速對(duì)吸附量的影響。上柱流速對(duì)吸附量的影響見(jiàn)圖5。上柱流速過(guò)快，多酚類化合物沒(méi)有被樹(shù)脂充分吸附，影響吸附量，上柱流速太慢，多酚類物質(zhì)可以充分吸收，但在工業(yè)化生產(chǎn)中則會(huì)影響生產(chǎn)效率，故應(yīng)選擇合適的上柱流速。從圖5 可看出，隨著上柱流速的增大，吸附率逐漸降低，故選擇較低流速有利于吸附率的增大，但如果流速太慢則會(huì)影響工作效率，綜合考慮樹(shù)脂的吸附性能及工作效率，確定吸附流速以3 BV/h為宜，3BV 時(shí)，樹(shù)脂的吸附率有95.82%。

（4）上樣體積的確定。泄漏曲線見(jiàn)圖6，由圖6 可以看出50 mL AB-8 樹(shù)脂處理700 mL（14BV）的原料液在上樣液為8 BV 時(shí)漏泄量較少，漏泄液中濃度約為上樣液濃度的1/10（泄漏液濃度為0.31 mg/ml），此時(shí)樹(shù)脂對(duì)油茶殼多酚的吸附量27.76 mg/mL，因此，選擇上樣體積為8BV。

圖5 上柱流速對(duì)吸附量的影響

圖6 樹(shù)脂的泄漏曲線

2.3.4 洗脫條件的確定

（1）洗脫溶劑的確定。不同濃度的乙醇對(duì)多酚的洗脫效果見(jiàn)圖7。從圖7 可以看出，洗脫液量達(dá)到6 BV 的時(shí)候，80%的乙醇基本能把油茶殼多酚從樹(shù)脂上洗下來(lái)，洗脫量達(dá)到了91.42%。由于多酚含有的酚羥基比較多，對(duì)樹(shù)脂的吸附能力較大，因此要選擇較高濃度的乙醇進(jìn)行洗脫為宜，但在工業(yè)化生產(chǎn)中，高濃度乙醇洗脫的成本較大，很難實(shí)現(xiàn)，因此本工藝選用80%的乙醇作為洗脫劑是較為合理的。

圖7 不同乙醇濃度對(duì)洗脫效果的影響

（2）洗脫流速的確定。不同流速對(duì)洗脫率的結(jié)果見(jiàn)圖8。從圖8 中可知，2 BV 和3 BV 的洗脫率都達(dá)到了95 以上，用相同體積的洗脫劑洗脫，流速越慢，洗脫率越高，但流速過(guò)慢，耗時(shí)間長(zhǎng)，不經(jīng)濟(jì)也不利于工業(yè)化生產(chǎn)。故綜合考慮，洗脫流速選擇3 BV/h 為宜。

（3）洗脫曲線的確定。洗脫曲線見(jiàn)圖9。從圖9 可以看出，當(dāng)洗脫液體積達(dá)到300 ml 左右，即6 倍量樹(shù)脂體積時(shí)，基本上能把吸附的多酚洗脫下來(lái)，洗脫率為92.71%。

圖8 洗脫流速對(duì)洗脫率的影響

圖9 樹(shù)脂的洗脫曲線

（4）最佳工藝條件的確定及樣品純度檢測(cè)。按上述所確定的最佳工藝條件，即料液濃度為3.78 mg/mL，料液pH 值在3.7，原料液以3 BV/h 的流速上柱吸附，再用6 倍樹(shù)脂體積的80%乙醇以3 BV/h 的流速解吸，進(jìn)行2次重復(fù)試驗(yàn)，洗脫液濃縮后冷凍干燥，得到棕色產(chǎn)品7.22g，取樣品進(jìn)行經(jīng)檢測(cè)，產(chǎn)品中多酚含量分別為62.5%、60.1%，平均多酚含量為61.3%。多酚回收率為77.64%。上柱原料液經(jīng)冷凍干燥，同法測(cè)定多酚含量為12.05%，表明經(jīng)AB-8 樹(shù)脂純化后多酚含量提高了5.08倍。樣品得率為2.95%。

3 結(jié)論

通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)對(duì)油茶殼中多酚類化合物分離純化工藝的摸索，AB-8 樹(shù)脂對(duì)油茶殼多酚具有良好的吸附性能。油茶殼樣品中多酚含量為12.05%。產(chǎn)品中多酚含量達(dá)61.3%，多酚回收率為77.64%。該工藝獲得產(chǎn)品純度較高，操作簡(jiǎn)單，方便，成本低，適合工業(yè)化生產(chǎn)，為多酚的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。

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