腐殖酸作用下沉積物中納米氧化銅對銅銹環(huán)棱螺生態(tài)毒性的影響

王 萌，馬陶武，龍 奕，劉珊珊，劉 佳，彭巾英

吉首大學(xué)生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，吉首 416000

腐殖酸作用下沉積物中納米氧化銅對銅銹環(huán)棱螺生態(tài)毒性的影響

王 萌，馬陶武*，龍 奕，劉珊珊，劉 佳，彭巾英

吉首大學(xué)生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，吉首 416000

為了探討不同水平腐殖酸作用下沉積物中納米氧化銅(CuO-NPs)對底棲生物生態(tài)毒理學(xué)效應(yīng)的影響，以銅銹環(huán)棱螺(Bellamyaaeruginosa)為受試生物，通過腐殖酸和CuO-NPs加標沉積物的慢性(28 d)生物測試，研究了肝胰臟中Cu的生物積累、Na+K+-ATP酶(ATPase)、超氧化物歧化酶(SOD)以及過氧化氫酶(CAT)活性的變化規(guī)律。結(jié)果表明，在低濃度CuO-NPs處理組(60 μg·g-1)，沉積物中腐殖酸水平對Cu的生物積累以及ATPase、SOD和CAT活性均沒有顯著影響。在中、高濃度CuO-NPs處理組(≥180 μg·g-1)，Cu的生物積累均隨腐殖酸水平的增加而顯著升高；肝胰臟ATPase活性隨腐殖酸水平的增加而顯著下降；當腐殖酸水平為0.05 g·g-1時，SOD活性顯著高于未添加腐殖酸組，表現(xiàn)為顯著誘導(dǎo)，當腐殖酸水平≥0.1 g·g-1時，SOD活性開始下降，并具有濃度依賴性；隨腐殖酸水平的增加，肝胰臟CAT活性總體上表現(xiàn)為濃度依賴性顯著下降。由于沉積物中腐殖酸的存在，顯著增加CuO-NPs在沉積物中的分散穩(wěn)定性，更容易被銅銹環(huán)棱螺攝取，從而通過增加CuO-NPs的生物積累而增強對銅銹環(huán)棱螺的生態(tài)毒性。

腐殖酸；納米氧化銅；生物積累；ATP酶；抗氧化酶；沉積物；銅銹環(huán)棱螺

隨著納米材料的大量生產(chǎn)和廣泛使用，人工納米顆粒(engineered nanoparticles，ENPs)將不可避免地釋放到環(huán)境中，成為一種新型污染物，極大地增加了人類和生態(tài)系統(tǒng)受到ENPs暴露的機會。由于水環(huán)境是所有污染物的最終沉積庫，所以ENPs將最終歸入水環(huán)境[1]，并在沉積物中積累，對水生底棲生物構(gòu)成潛在的威脅。由于ENPs特殊的理化性質(zhì)和沉積物介質(zhì)的復(fù)雜性，使得進入沉積物中納米顆粒的生態(tài)毒理學(xué)問題變得更為復(fù)雜。水環(huán)境介質(zhì)中諸多因素可能影響ENPs的性質(zhì)，進而影響到ENPs對底棲生物的生物有效性和生態(tài)毒理學(xué)效應(yīng)。ENPs的環(huán)境化學(xué)研究顯示，天然有機大分子可以包被ENPs并使其穩(wěn)定地分散在環(huán)境介質(zhì)中[2-3]；沉積物中有機質(zhì)含量是影響ENPs遷移能力和環(huán)境行為的重要因素[4-7]。

溶解性有機質(zhì)廣泛存在于天然水環(huán)境中，腐殖酸(humic acid，HA)是其中尤為重要的組分。腐殖酸具有較強的絡(luò)合、螯合、吸附和氧化還原能力，對有機、無機化合物在自然界的遷移、轉(zhuǎn)化和歸宿具有非常重要的影響[8]。

納米氧化銅(CuO-NPs)是一類十分重要的納米材料，由于其具有獨特的高溫超導(dǎo)性、電子關(guān)聯(lián)效應(yīng)(較窄的能帶隙和自旋動力學(xué)特性)、極高的催化活性和抑菌作用[9-10]，在工業(yè)上得到廣泛的應(yīng)用。目前，關(guān)于CuO-NPs的毒性和生態(tài)毒性效應(yīng)已有一些報道，這些報道主要探討了CuO-NPs對離體細胞、微生物、藻類、原生動物、甲殼動物、海生雙殼類、兩棲動物、哺乳動物以及高等植物的毒性和毒作用機理。研究顯示，CuO-NPs的生物有效性和生物積累性高于常規(guī)氧化銅，如CuO-NPs可以積累在甲殼動物腸道內(nèi)[11]，尤其對于攝食顆粒的生物而言，CuO-NPs在腸內(nèi)的生物有效性更高[12]；還有研究指出CuO-NPs比Cu2+更容易進行生物積累[13]；另有證據(jù)顯示CuO-NPs比常規(guī)氧化銅和同類型的其它納米顆粒的毒性更強[114]。然而目前基于底棲動物的有機質(zhì)對沉積物中ENPs生態(tài)毒理學(xué)效應(yīng)影響的研究還未見報道。

本研究以實驗室培養(yǎng)的淡水腹足類底棲動物銅銹環(huán)棱螺(Bellamyaaeruginosa)為受試生物，以Cu的生物積累、能量生物標志物Na+K+-ATP酶(ATPase)、抗氧化生物標志物超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)作為測試指標，采用沉積物生物測試研究不同水平腐殖酸作用下沉積物CuO-NPs對銅銹環(huán)棱螺生態(tài)毒理學(xué)效應(yīng)的影響，以期為合理評價沉積物中CuO-NPs的生態(tài)毒理學(xué)效應(yīng)及其潛在生態(tài)風(fēng)險提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗動物

實驗所用銅銹環(huán)棱螺(Bellamyaaeruginosa)為相同年齡，大小均勻的健康個體，年齡為4月齡、殼長為(16.28 ± 1.15)mm，體重為(1.24 ± 0.23)g，在實驗室人工控制條件下按照Ma等的方法[15]進行培養(yǎng)。

1.2 實驗沉積物

實驗所用沉積物為采自湖南吉首市德夯自然保護區(qū)內(nèi)的無污染自然沉積物。用塑料鏟采集表層沉積物樣品(0～10 cm厚度)，然后用孔徑0.2 mm的尼龍篩現(xiàn)場擠壓過篩，去除雜物和粗顆粒，靜置，倒掉上覆水，并將所采集的多個沉積物樣品充分混合均勻，裝入聚乙烯塑料袋中，運回實驗室。分析表明，該沉積物由淤泥和粘土組成，分別占33.64%和66.36%，總有機碳TOC 4.48%，pH 7.78，總氮TN 1 064 mg·kg-1，總磷TP 1 215 mg·kg-1。

1.3 儀器與試劑

儀器：UV-757CRT 紫外可見分光光度計(上海精科)；TGL-16M臺式高速冷凍離心機(長沙平凡)；電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(ICP-OES，iCAP6300 Radial，ThermoFisher Scientific，USA)；玻璃勻漿器。

試劑：氧化銅納米顆粒(CuO-NPs，CAS# 1317-38-0，40 nm，純度99.5%，日本三菱)；腐殖酸(天津市光復(fù)精細化工研究所)；超微量ATP酶、超氧化物歧化酶與過氧化氫酶活性測定試劑盒以及蛋白測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟(PMSF)購自Genview公司；蔗糖、Tris、EDTA-Na2及其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.4 實驗設(shè)計

實驗共設(shè)13個處理組，包括對照組；低(60 μg·g-1)、中(180 μg·g-1)和高濃度(540 μg·g-1)CuO-NPs單獨處理組及分別與低(0.05 g·g-1)、中(0.1 g·g-1)和高濃度(0.2 g·g-1)腐殖酸的聯(lián)合處理組，每個處理組設(shè)3個重復(fù)。加標前，先測定濕沉積物(以能攪動為宜)的干濕比，計算每個處理所需濕沉積物和相應(yīng)CuO-NPs及腐殖酸的量，然后按CuO-NPs和腐殖酸的加標濃度稱取CuO-NPs干粉和腐殖酸分別加入相應(yīng)的沉積物中，在玻璃缸中用干凈的小木鏟邊加邊攪拌，加完后再持續(xù)攪拌至少1 h。加標玻璃缸在室溫下儲存30 d，在儲存期間，每隔3 d對加標沉積物充分攪拌1次以使CuO-NPs和腐殖酸在沉積物中達到均勻分布。對照組沉積物除不加CuO-NPs和腐殖酸外，按相同方式處理。

實驗開始前，按沉積物與上覆水體積比1∶4 的比例，將每個處理的測試沉積物分別加到相應(yīng)的測試缸(4 L)中，然后加上覆水(去氯自來水)至滿，加水過程盡可能減少對沉積物的擾動。所有測試缸置于一個水浴控溫的有機玻璃容器中，靜置24 h。實驗開始時，將所選實驗動物隨機分配到每個測試缸中(10只/缸)，采用上覆水連續(xù)更新的方式進行毒性測試[15]。暴露實驗持續(xù)28 d，光照周期為12 h(白晝)：12 h(黑暗)，維持水溫(24±1)℃。每日投喂人工餌料1次，每隔3 d檢查1次水質(zhì)。實驗結(jié)束后，將實驗螺取出，洗凈，用鉗子夾破螺殼，從內(nèi)臟團中分離出肝胰臟，稱重，將一部分個體的肝胰臟樣品直接放入液氮中速凍保存，用于生化測定，另一部分保存于-20℃的冰箱中，用于測定Cu的生物積累。

1.5 生化測定

取冷凍的肝胰臟樣品，按1∶4(g·mL-1)的比例加入含0.0001 mol·L-1EDTA-Na2、0.01 mol·L-1蔗糖和0.8% NaCl的Tris-HCl勻漿(0.01 mol·L-1、pH = 7.4)介質(zhì)，同時加入苯甲基磺酰氟(PMSF終濃度為1 mmol·L-1)，用玻璃勻漿器在冰浴下制成勻漿，然后于4℃、10 000 r·min-1下離心10 min，取上清液，即得20%的勻漿液，置液氮中保存?zhèn)錅y，測定時用勻漿介質(zhì)稀釋到1%。采用鉬藍法測定Na+K+-ATPase活性；采用考馬斯亮藍法測定蛋白含量；采用羥胺法測定SOD活性；采用紫外分光光度法測定過CAT活性，具體測定操作和計算按南京建成生物工程研究所的試劑盒說明書進行。ATPase、SOD和CAT活性分別以活力單位U·mg-1、U·mg-1和U·g-1(以蛋白計)表示。

1.6 Cu生物積累測定

將肝胰臟在80℃下烘干，稱重，采用HNO3-HClO4消解法[16]對組織樣品進行消解，通過ICP-OES測定Cu的含量。同時采用標準物質(zhì)貽貝(GBW08571，北京世紀奧科生物技術(shù)有限公司)進行質(zhì)量控制，結(jié)果表明該方法具有良好的準確度和精密度。

1.7 統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0進行統(tǒng)計分析。對實驗數(shù)據(jù)先進行正態(tài)分布檢驗，然后利用單因素方差分析法(ANOVA)和多重比較檢驗法(LSD)進行組間差異顯著性檢驗，差異顯著性水平為0.05，實驗結(jié)果以平均值±標準差表示。

2 結(jié)果與分析(Results and analysis)

2.1 肝胰臟中Cu的生物積累

在不同腐殖酸水平下，28 d慢性暴露后，不同濃度CuO-NPs處理組中銅銹環(huán)棱螺肝胰臟Cu的生物積累情況見圖1?？傮w上，各處理組Cu的含量是對照組(110.45 μg·g-1干重)的2～3倍，CuO-NPs暴露導(dǎo)致Cu在銅銹環(huán)棱螺肝胰臟中顯著積累。在低濃度CuO-NPs處理組(60 μg·g-1)，沉積物中腐殖酸水平對Cu的生物積累沒有影響。在中、高濃度CuO-NPs處理組，未加腐殖酸時，Cu的生物積累不隨CuO-NPs濃度的升高而增加，處于穩(wěn)定水平(200 μg·g-1干重)；當添加腐殖酸時，Cu的生物積累均隨腐殖酸水平的增加而顯著升高，最高值分別達到275.23和338.33 μg·g-1干重。

2.2 不同水平腐殖酸作用下CuO-NPs對銅銹環(huán)棱螺肝胰臟Na+K+-ATPase活性的影響

不同水平腐殖酸作用下CuO-NPs慢性暴露(28 d)對銅銹環(huán)棱螺肝胰臟Na+K+-ATPase活性的影響如圖2所示。Na+K+-ATPase是主動運輸所需要的特殊的運載酶，是生物體內(nèi)重要的代謝酶之一，當生物受到生理脅迫時，ATPase活性會隨之變化，ATPase活性是一個廣泛用于評價污染壓力的重要分子生態(tài)毒理學(xué)生物標志物。在低濃度CuO-NPs處理組(60 μg·g-1)，與對照組(1.62 U·mg-1蛋白)相比，ATPase活性均表現(xiàn)為顯著升高，但不同腐殖酸水平對ATPase活性沒有影響。在中、高濃度CuO-NPs處理組，隨腐殖酸水平的增加，ATPase活性均表現(xiàn)濃度依賴性顯著下降，在最高腐殖酸水平(0.1 g·g-1)時，ATPase活性分別下降到1.25和0.74 U·mg-1蛋白，為對照組的77%和48%。

2.3 不同水平腐殖酸作用下CuO-NPs對銅銹環(huán)棱螺肝胰臟SOD活性的影響

圖1 沉積物中不同腐殖酸水平作用下28 d暴露后銅銹 環(huán)棱螺肝胰臟中Cu的生物積累(在相同CuO-NPs濃度的不同 腐殖酸水平處理組標有不同字母表示差異顯著， p<0.05，下同)Fig. 1 Bioaccumulation of Cu in the hepatopancreas of Bellamya aeroginosa following 28-d exposure to sediments with different humus acid (HA) levels (HA Treatments with same CuO-NPs concentration labeled with different letters differed significantly, p < 0.05. The same below)

圖2 沉積物中不同腐殖酸水平作用下28 d 暴露后銅銹環(huán)棱螺肝胰臟Na+K+-ATPase活性Fig. 2 Na+K+-ATPase activities in the hepatopancreas of Bellamya aeroginosa following 28-d exposure to sediments with different humus acid (HA) levels

圖3 沉積物中不同腐殖酸水平作用下28 d 暴露后銅銹環(huán)棱螺肝胰臟SOD活性Fig. 3 SOD activities in the hepatopancreas of Bellamya aeroginosa following 28-d exposure to sediments with different humus acid (HA) levels

2.4 不同水平腐殖酸作用下CuO-NPs對銅銹環(huán)棱螺肝胰臟CAT活性的影響

不同水平腐殖酸作用下CuO-NPs慢性暴露(28天)對銅銹環(huán)棱螺肝胰臟CAT活性的影響如圖4所示。CAT也是生物體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)中的關(guān)鍵酶類之一，主要將H2O2轉(zhuǎn)化為H2O， CAT亦常與SOD一起用作指示環(huán)境污染脅迫的重要生物標志物。低濃度CuO-NPs處理組(60 μg·g-1)的CAT活性與對照組相比差異不顯著，而且沉積物中腐殖酸水平對CAT活性也沒有影響。在中、高濃度CuO-NP處理組，隨腐殖酸水平的增加，CAT活性總體上表現(xiàn)為濃度依賴性下降。當腐殖酸水平為0.1和0.2 g·g-1時，CAT活性隨CuO-NPs濃度的增加均呈現(xiàn)急劇下降的趨勢，分別為對照組的55%和40%。

圖4 沉積物中不同腐殖酸水平作用下28 d 暴露后銅銹環(huán)棱螺肝胰臟CAT活性Fig. 4 CAT activities in the hepatopancreas of Bellamya aeroginosa following 28-d exposure to sediments with different humus acid (HA) levels

3 討論(Discussion)

有研究指出天然有機質(zhì)的存在可以增強ENPs對測試生物的毒性。Lin等的研究[7]發(fā)現(xiàn)天然有機質(zhì)的存在顯著增大了碳納米顆粒的毒性。金霏霏等[17]研究了不同濃度HA對ZnO-NPs毒性效應(yīng)的影響，發(fā)現(xiàn)HA濃度的增加明顯促進ZnO-NPs對鯽魚肝臟和腦部的氧化損傷。本研究顯示，在0.05～0.2 g·g-1腐殖酸水平范圍內(nèi)，沉積物中低濃度的CuO-NPs(60 μg·g-1)對銅銹環(huán)棱螺肝胰臟ATPase、SOD和CAT活性幾乎沒有影響；而當沉積物中的CuO-NPs濃度較高(≥180 μg·g-1)時，3種酶的活性均隨腐殖酸水平的增加明顯降低，提示在腐殖酸存在的情況下，CuO-NPs對銅銹環(huán)棱螺肝胰臟細胞產(chǎn)生了明顯的氧化脅迫，因此沉積物中較高水平的腐殖酸可以增強CuO-NPs對銅銹環(huán)棱螺的肝胰臟毒性。這與前述研究的結(jié)果基本一致。朱江等利用大型溞(Daphniamagna)研究了沉積物中腐殖質(zhì)對銅毒性的影響[18]，發(fā)現(xiàn)沉積物間隙水中銅離子對大型溞的毒性隨沉積物中腐殖質(zhì)含量的升高而減弱，但隨沉積物中總銅含量的增加而增強，這說明，沉積物中銅離子和CuO-NPs對生物的生態(tài)毒性影響機制是不同的，也與生物種屬有關(guān)。腐殖質(zhì)是金屬在沉積物中的主要吸附相[19-20]，銅在沉積物中能與腐殖質(zhì)形成競爭性的有機絡(luò)合物[21]，沉積物中腐殖質(zhì)的濃度會影響金屬在沉積物/間隙水相間的分配，引起間隙水中有關(guān)化合物濃度的變化，最終影響間隙水對大型溞的毒性。而Chen & Elimlech[2]和Giashuddin等[3]指出，天然有機大分子可以包被ENPs并使其穩(wěn)定地分散在環(huán)境介質(zhì)中；Hyung等的研究[22]證實，腐殖質(zhì)可以在C60-NPs和碳納米管的表面形成表面包被，這種表面包被通過增加靜電排斥作用抑制了ENPs的團聚，從而增加了ENPs在介質(zhì)中的分散穩(wěn)定性。因此，測試體系中ENPs的分散效果及對生物的毒性在很大程度上受介質(zhì)中有機質(zhì)水平的影響。在本研究中，在CuO-NPs中、高濃度處理組，銅銹環(huán)棱螺肝胰臟Cu的生物積累隨腐殖酸水平的增加而顯著升高，這是由于腐殖酸的存在，顯著增加CuO-NPs在沉積物中的分散穩(wěn)定性，更容易被銅銹環(huán)棱螺攝入，從而通過增加CuO-NPs的生物積累而增強對銅銹環(huán)棱螺的毒性。因此，腐殖酸對沉積物中ENPs生態(tài)毒理學(xué)效應(yīng)的影響與腐殖酸的水平和ENPs的濃度均有關(guān)。因此在關(guān)注ENPs的潛在生態(tài)風(fēng)險時，應(yīng)當考慮相關(guān)環(huán)境因子的影響。

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ImpactsofHumicAcidonEcotoxicityofCuONanoparticleinBellamyaaeruginosaundertheSedimentScenario

Wang Meng, Ma Taowu*, Long Yi, Liu Shanshan, Liu Jia, Peng Jinying

College of Biology and Environmental Science, Jishou University, Jishou 416000, China

15 April 2014accepted23 May 2014

The effects of with humic acid (HA) and CuO nanoparticles (CuO-NPs) in sediments on Cu accumulation, Na+K+-ATPase, SOD, and CAT activities in the hepatopancreas ofBellamyaaeruginosafollowing a 28-d chronic bioassay were investigated to get insight into the ecotoxicological effects of CuO-NPs in sediments with various gradient of HA on benthic macroinvertebrates. The results indicated that, at low concentration of CuO-NPs (60 g·g-1), the content of HA had no effects on the hepatopancreatic Cu accumulation, Na+K+-ATPase, SOD, and CAT activities. At CuO-NPs concentration of 180 g·g-1or above, Cu accumulation raised significantly with increase of HA content, however ATPase activities decreased significantly when enhancing HA content. At HA content of 0.05 g·g-1, SOD activities were significantly higher than that in the free HA groups, indicating a marked induction. However, at HA content of 0.1 g·g-1or above, SOD activities showed a content-dependent decline of HA. Generally, the hepatopancreatic CAT activities increased significantly with increase of HA content. The HA in sediments could reduce the aggregation of CuO NPs and enhance its homogeneous dispersion, which facilitated ingestion of CuO-NPs byB.aeroginosa, so the increased Cu accumulation enhanced its ecotoxicity.

humic acid; CuO nanoparticles; bioaccumulation; Na+K+-ATPase; antioxidant enzyme; sediments;Bellamyaaeruginosa

2014-04-15錄用日期：2014-05-23

1673-5897(2014)4-803-06

： X171.5

： A

馬陶武(1968—)，男，博士，教授，主要研究方向為水生態(tài)毒理學(xué)，發(fā)表論文40余篇。

國家自然科學(xué)基金項目(No. 41171383)

王萌(1988-)，男，碩士研究生，研究方向為生態(tài)毒理學(xué)，E-mail：wangmeng433101@126.com；

*通訊作者(Corresponding author)，E-mail: mtw922@163.com

10.7524/AJE.1673-5897.20140415001

王 萌, 馬陶武, 龍 奕, 等. 腐殖酸作用下沉積物中納米氧化銅對銅銹環(huán)棱螺生態(tài)毒性的影響[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報, 2014, 9(4): 803-808

Wang M, Ma T W, Long Y, et al. Impacts of humic acid on ecotoxicity of CuO nanoparticle inBellamyaaeruginosaunder the sediment scenario [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2014, 9(4): 803-808 (in Chinese)