外源NO介導(dǎo)Cu2+脅迫下番茄幼苗活性氧與內(nèi)源NO代謝的研究

王逸筠，李曉云，王 建，崔秀敏

山東農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院 土肥資源高效利用國家工程實驗室，泰安 271018

外源NO介導(dǎo)Cu2+脅迫下番茄幼苗活性氧與內(nèi)源NO代謝的研究

王逸筠，李曉云，王 建，崔秀敏*

山東農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院 土肥資源高效利用國家工程實驗室，泰安 271018

采用營養(yǎng)液培養(yǎng)方法，研究Cu2+脅迫下外源一氧化氮(nitric oxide，NO)介導(dǎo)的番茄幼苗活性氧及NO代謝途徑。結(jié)果表明：在Cu2+脅迫下，番茄葉片和根系氧自由基含量增加，NO釋放量以及硝酸還原酶(nitrate reductase，NR)和一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)活性降低。外源NO能提高Cu2+脅迫下番茄葉片NR和NOS活性，促進(jìn)NO的產(chǎn)生，根系NOS活性及NO產(chǎn)量也同時上升。外源NO使精氨酸含量顯著增加，而Hb(牛血紅蛋白，NO清除劑)可部分抵消NO的促進(jìn)作用，使Cu2++SNP+Hb處理下番茄精氨酸含量顯著下降。可見，外源NO的加入可通過酶促和非酶促途徑促進(jìn)Cu2+脅迫下NO的合成，介導(dǎo)NO信號調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，調(diào)節(jié)內(nèi)源NO、精氨酸和活性氧代謝途徑，從而緩解過多Cu2+引起的氧化傷害。

番茄；Cu2+脅迫；一氧化氮；活性氧；精氨酸；一氧化氮代謝

Cu2+是植物必需微量元素，廣泛參與各種生命活動。同時作為重金屬元素，Cu2+過量會對植物造成嚴(yán)重傷害，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)生物代謝紊亂，最終抑制植物生長[1]。Cu2+對植物細(xì)胞的脅迫癥狀之一是活性氧(ROS)積累導(dǎo)致的膜脂過氧化作用。

NO是結(jié)構(gòu)簡單、高脂溶性、極不穩(wěn)定的小分子氣體，易通過擴(kuò)散方式透過細(xì)胞膜。同時NO具有信號分子的作用，可以減少非生物脅迫下植物體內(nèi)活性氧的積累，緩解各種脅迫造成的氧化傷害，從而增強(qiáng)植物的適應(yīng)能力。植物體內(nèi)NO的來源主要有一氧化氮合酶(NOS)途徑，硝酸還原酶(NR)途徑和非酶促途徑，如經(jīng)反硝化作用和氮固定形成NO；硝化作用和反硝化作用將N2O氧化成NO；酸性條件下，由NO2還原形成NO；由類胡蘿卜素轉(zhuǎn)化的光介導(dǎo)非酶促反應(yīng)形成NO；抗壞血酸或光參與由NO2形成NO。植物體中還有依賴L-精氨酸的NO產(chǎn)生的途徑存在(如圖1)。NR可將硝酸根還原成亞硝酸根，進(jìn)一步亞硝酸根還原成NO[2]。在酸性或還原環(huán)境中，亞硝酸的還原亦會形成NO。亞硝酸與抗壞血酸反應(yīng)能夠形成NO和脫氫抗壞血酸[3]。

圖1 植物精氨酸代謝與多胺和一氧化氮產(chǎn)生的關(guān)系Fig. 1 Relationship between arginine metabolism and the biosynthesis of both polyamines and nitric oxide in plants

研究表明，外源NO能夠提高Cu2+脅迫下番茄植株的抗氧化能力和重金屬耐性[4]，適當(dāng)濃度的NO能有效提高生物抗氧化酶的活性，如過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)比活性，緩解重金屬引起的氧化傷害[5]，另一方面，其作為信號分子，NO可上調(diào)ROS清除系統(tǒng)(如抗氧化酶SOD、CAT、POD、GPX等)的相關(guān)基因的表達(dá)，減少ROS過量積累以抵御脅迫傷害。然而這些研究主要集中在外源NO供體的作用下對植物抗逆性的影響，而對于內(nèi)源NO代謝途徑研究很少。本試驗以“改良毛粉802F1”番茄種子為試材，采用NO供體硝普鈉(SNP)處理Cu2+脅迫下番茄幼苗，探討外源NO介導(dǎo)的Cu2+脅迫下番茄幼苗活性氧的變化認(rèn)及對NO代謝的影響。

1 材料和方法(Materials and methods)

1.1 供試材料與試驗設(shè)計

供試材料：“改良毛粉802F1”番茄種子，Hoagland營養(yǎng)液。

試驗在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)智能溫室內(nèi)進(jìn)行，用Hoagland營養(yǎng)液培養(yǎng)幼苗。種子經(jīng)55 ℃溫湯浸種消毒15 min，然后在潤濕的吸水紙上26 ℃催芽。待種子露白后，播于洗凈的蛭石中，萌發(fā)后用1/4 Hoagland營養(yǎng)液澆灌。當(dāng)幼苗具有3～4片真葉時，挑選生長一致的植株洗凈根部蛭石后，移栽于4 L塑料桶中，用厚度為3 cm的泡沫塑料板做成長方形蓋子，覆蓋在塑料桶頂部。每盆栽4株，用1/2Hoagland營養(yǎng)液進(jìn)行栽培。1周后換成完全營養(yǎng)液，此后每3 d更換1次營養(yǎng)液。營養(yǎng)液栽培期間用電動氣泵24 h連續(xù)通氣。

番茄植株長至5～6片真葉時進(jìn)行銅離子脅迫處理。分別向營養(yǎng)液中加入CuCl2、SNP和Hb。試驗設(shè)5個處理：(1)完全營養(yǎng)液(CK)；(2)50 μmol·L-1CuCl2Cu2+脅迫處理(CK+Cu2+);(3)50 μmol·L-1CuCl2+100 μmol·L-1SNP，NO緩解處理(Cu2++SNP)；(4)50 μmol·L-1CuCl2+100 μmol·L-1SNP+0.1% Hb，(Cu2++SNP+Hb)。每個處理重復(fù)4次，溫室內(nèi)隨機(jī)排列。用低濃度的KOH或者HCl調(diào)節(jié)pH至5.5±0.2，處理8 d后，收獲植株。

1.2 測定項目與方法

1.2.1 植株生長量的測定

收獲番茄植株后，將葉片和根系分開，用蒸餾水沖洗干凈，吸水紙吸干，直接測定鮮重(FW)。

1.2.2 丙二醛和過氧化氫含量的測定

丙二醛含量的測定參照趙世杰的方法[6]，取0.5 g新鮮植株樣品(葉、根)加入5%三氯乙酸5 mL，研磨后所得勻漿在3 000 rpm下離心10 min，取上清液，即為酶提取液。取酶液1 mL，加入2 mL硫代巴比妥酸溶液(0.67%)，沸水浴15 min， 4 000 rpm離心15 min，分別將上清液在450 nm，532 nm，600 nm下比色。

過氧化氫含量的測定參照Patterson等[7]的方法。取0.5 g葉片用6 mL冷丙酮研磨，2 500 rmp 離心10 min，取l mL上清液，加入0.l mL四氯化鈦(TiC14)濃鹽酸溶液(20%)，0.2 mL氨水，2 500 rmp離心10 min，用丙酮懸浮洗滌沉淀5次，將沉淀溶于3 mL 1 mol·L-1的硫酸中，測定OD410。

1.2.3 植物根系活力測定

根系活力采用氯化三苯基四氮唑(TTC)法測定[6]，用四氮唑的還原強(qiáng)度(μg·g-1·h-1) 表示根系活力。將番茄根系洗凈，吸干表面水后剪碎，均勻稱取0.4 g于試管中，加入0.4% TTC和磷酸緩沖液的等量混合液10 mL，37 ℃保溫4 h，加入1 mol·L-1H2SO42 mL終止反應(yīng)，放置15 min后，取出根系吸干，加入10 mL 95%的乙醇提取24 h后，于485 nm下比色。

1.2.4 精氨酸含量測定

參考Sakaguchi 和胡桂娟等 的方法[8-9]。植物材料用10%(w/v)三氯乙酸按1:10(w/v)的比例冰浴研磨，1 457 rmp冷凍離心10 min，上清液為精氨酸提取液。一定量上清液按順序加入3%(w/v)NaOH、0.15%(w/v)1-萘酚，再加入50%(v/v)安替福民(次氯酸鈉溶液)啟動反應(yīng)，530 nm比色測定。

參考Elstner的方法[10]，植物材料按1:5(w/v)的比例用50 mmol·L-1PBS(pH=7.8)冰浴研磨，1 278 rmp 4 ℃離心15 min。上清液加10 mmol·L-1鹽酸羥胺，25 ℃保溫20 min后再加入17 mmol·L-1對氨基苯磺酸和7 mmol·L-1α-萘胺，25 ℃保溫20 min，正丁醇萃取，測530 nm比色。

1.2.6 CAT比活性測定

采用Cakmak和Marschner的方法[11]。取上清液100 μL，加25 mmol·L-1磷酸緩沖液(pH=7.0，含0.1 mmol·L-1的EDTA)1 700 μL，10 mmol·L-1H2O2200 μL，25 ℃下反應(yīng)。用紫外可見分光光度計(SHIMADZU UV-2450)按Kinetics程序測定OD240，取其中20 s的動力學(xué)變化計算酶促反應(yīng)速率。

1.2.7 內(nèi)源NO含量測定

根據(jù)Murphy和Noack[12]方法稍加改進(jìn)測定內(nèi)源NO。取0.5 g切成1 cm長的新鮮葉片，在含100UCAT和100USOD的溶液中浸泡5 min，以除去植物內(nèi)源的活性氧，然后加入10 mL純化好的血紅蛋白溶液反應(yīng)2 min，測定反應(yīng)液在577 nm和591 nm吸光值，根據(jù)公式C=(OD577-OD591) /11.2計算NO的釋放率。

1.2.8 硝酸還原酶活性的測定

采用活體法測定硝酸還原酶活性[6]。稱取樣品0.5 g 3份，放入帶編號的試管中。分別向試管加入KNO3-異丙醇-磷酸緩沖混合液9 mL，其中一管立即加1.0 mL三氯乙酸混勻之后作空白對照。將試管放入真空干燥器，抽氣，直到樣品葉片全部沉在管底。然后把試管放在30 ℃下于黑暗處保持溫度30 min，分別向處理管加1.0 mL三氯乙酸溶液，搖勻以終止酶活性。靜置2 min，吸取上2 mL清液加入另一組試管，以對照管作參比，按標(biāo)準(zhǔn)曲線做法進(jìn)行顯色測定，計算酶活性。

1.2.9 一氧化氮合酶(NOS)活性的測定

采用NOS試劑盒測定NOS活性。1.000 g葉片加入50 mmol·L-1pH 7.2的緩沖液1 mL冰浴研磨，3 mL緩沖液沖洗，10 000 rmp冷凍離心 10 min。參考試劑盒說明書進(jìn)行測定(試劑盒購自南京建成生物工程研究所)：0.4 mL上清液依次加0.2 mL底物緩沖液、0.01 mL促進(jìn)劑、0.1 mL顯色劑，混勻，37oC水浴準(zhǔn)確反應(yīng)5 min，然后依次加0.1 mL透明劑、2 mL終止液，混勻，蒸餾水調(diào)零，530 nm比色測定，每個處理重復(fù)3次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理及繪圖，采用SAS統(tǒng)計軟件對平均數(shù)進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析(Results and analysis)

2.1 外源NO對Cu2+脅迫下番茄氧自由基釋放量的影響

Cu2+處理的番茄葉片氧自由基釋放速率比CK增加53.0%，差異顯著。與Cu2+處理相比，Cu2++SNP處理番茄葉片氧自由基釋放速率降低7.7%。Cu2++SNP處理番茄葉片氧自由基釋放速率比CK增加41.21%。Cu2++SNP+Hb處理番茄葉片氧自由基釋放速率比Cu2++SNP處理增加27.67%，達(dá)顯著水平(圖2-A)。

與CK相比，Cu2+處理番茄根系氧自由基釋放速率增加30.7%，達(dá)顯著水平。Cu2++SNP處理比Cu2+處理根系氧自由基釋放速率差異不顯著。Cu2++SNP處理番茄根系氧自由基釋放速率比CK增加28.05%。與Cu2++SNP處理相比，Cu2++SNP+Hb處理番茄根系氧自由基釋放速率增加13.63%(圖2-B)。

圖2 外源NO對Cu2+毒害下番茄葉片(A)和根系(B)中釋放速率的影響Fig. 2 Effects of exogenous NO on the production rate of · in tomato leaves(A)and roots(B)under Cu2+ stress

2.2 外源NO對Cu2+脅迫下番茄過氧化氫含量的影響

如圖3-A所示，與CK相比，Cu2+處理番茄葉片H2O2含量增加1.1倍，差異顯著。Cu2++SNP處理的番茄葉片H2O2含量降低47.4%，差異顯著。與Cu2+處理相比，Cu2++SNP處理番茄葉片H2O2含量降低47.36%，差異顯著。Cu2++SNP+Hb處理番茄葉片H2O2含量比Cu2++SNP處理增加40.63%，差異顯著。

Cu2+處理下番茄根系H2O2含量比CK增加87.3%，差異顯著。與Cu2+處理相比，Cu2++SNP處理番茄根系H2O2含量降低38.4%，差異顯著。Cu2++SNP處理番茄根系H2O2含量比CK增加15.3%。Cu2++ SNP+Hb處理番茄根系H2O2含量比Cu2++SNP處理增加39.6%，差異顯著(圖3-B)。

2.3 外源NO對Cu2+脅迫下番茄MDA含量的影響

如圖4-A，Cu2+處理番茄葉片MDA含量比CK降低34.4%，差異顯著。與Cu2+處理相比，Cu2++SNP處理番茄葉片MDA含量增加14.9%，差異顯著。Cu2++SNP處理的番茄葉片MDA含量比CK增加14.4%。與Cu2++SNP處理相比，Cu2++SNP+Hb處理番茄葉片MDA含量增加8.6%。

與CK相比，Cu2+處理番茄根系MDA含量增加3.0倍，差異顯著。Cu2++SNP處理番茄根系MDA含量比Cu2+處理降低30.4%，差異顯著。與CK相比，Cu2++SNP處理番茄根系MDA含量減少64.16%，差異顯著。與Cu2++SNP處理相比，Cu2++SNP+Hb處理的番茄根系MDA含量增加57.89%，差異顯著(圖4-B)。

圖3 外源NO對Cu2+脅迫下番茄幼苗葉片(A)和根系(B)H2O2含量的影響Fig. 3 Effects of exogenous NO on the content of H2O2 in tomato leaves(A)and roots(B)under Cu2+ stress

圖4 外源NO對Cu2+脅迫下番茄幼苗葉片(A)和根系(B)MDA含量的影響Fig. 4 Effects of exogenous NO on MDA content in tomato leaves(A)and roots(B)under Cu2+ stress

2.4 外源NO對Cu2+脅迫下番茄CAT活性的影響

與CK相比，Cu2+處理的番茄葉片CAT活性降低35.4%，差異顯著。Cu2++SNP處理的番茄葉片CAT活性提高39.5%，差異極顯著。與Cu2+處理相比，Cu2++SNP處理番茄葉片CAT活性升高39.48%，差異顯著。與Cu2++SNP處理相比，Cu2++SNP+Hb處理的番茄葉片CAT活性降低45.22%，差異顯著(圖5-A)。

Cu2+處理的番茄根系CAT活性比CK降低30.9%，差異顯著。與Cu2+處理相比，Cu2++SNP處理的番茄根系CAT活性提高16.7%，差異顯著。Cu2++SNP處理的番茄根系CAT活性比CK處理降低19.39%。與Cu2++SNP處理相比，Cu2++SNP+Hb處理的番茄根系CAT活性減少62%，差異極顯著(圖5-B)。

2.5 外源NO對Cu2+脅迫下番茄硝酸還原酶活性和根系活力的影響

由圖6-A可見，與CK相比，Cu2+處理葉片NR活性降低15.4%，差異顯著。Cu2++SNP處理葉片NR活性比Cu2+處理增加53%，達(dá)極顯著水平。Cu2++SNP處理葉片NR活性比CK處理增加29.6%，達(dá)極顯著水平。Cu2++SNP+Hb處理葉片NR活性比Cu2++SNP處理減少40.66%，差異極顯著。

與CK相比，Cu2+處理的根系活力降低40.7%，達(dá)極顯著水平。Cu2++SNP處理的根系活力比Cu2+處理提高20.2%，差異顯著。Cu2++SNP處理根系活力比CK降低28.74%。Cu2++SNP+Hb處理根系活力比Cu2++SNP處理減少30.85%，差異顯著，說明外源NO能夠部分緩解Cu2+脅迫對根系活力的抑制，但不能完全逆轉(zhuǎn)(圖6-B)。

圖5 外源NO對Cu2+毒害下番茄葉片(A)和根系(B)中CAT活性的影響Fig. 5 Effects of exogenous NO on the CAT activity in tomato leaves(A)and roots(B)under Cu2+ stress

圖6 外源NO對Cu2+脅迫下番茄幼苗葉片NR活性(A)和根系活力(B)的影響Fig. 6 Effects of exogenous NO on the NR activity in tomato leaves(A)and the root activity(B)under Cu2+ stress

2.6 外源NO對Cu2+脅迫下番茄NO釋放量的影響

Cu2+處理下番茄葉片NO釋放量比CK降低12.6%，差異顯著。與Cu2+處理相比，Cu2++SNP處理番茄葉片NO釋放量增加34.0%，差異顯著。Cu2++SNP處理番茄葉片NO釋放量比CK降低3.73%。Cu2++SNP+Hb處理番茄葉片NO釋放量比Cu2++SNP處理減少9.96%(圖7-A)。

與CK相比，Cu2+處理番茄根系NO釋放量降低22.1%，差異顯著。Cu2++SNP處理的番茄根系NO釋放量比Cu2+處理增加36.0%，差異顯著。Cu2++SNP處理番茄根系NO釋放量比CK增加6%。與Cu2++SNP處理相比，Cu2++SNP+Hb處理番茄根系NO釋放量減少11.06%(圖7-B)?？梢姡庠碞O可以有效激發(fā)內(nèi)源NO的合成，而Hb可以部分減緩這種刺激效應(yīng)。

2.7 外源NO對Cu2+脅迫下番茄NOS活性的影響

番茄葉片和根系NOS活性變化趨勢相似。與CK相比，Cu2+處理的番茄葉片NOS活性降低12%。Cu2++SNP處理的番茄葉片NOS活性比Cu2+處理提高55.63%，差異極顯著。與CK相比，Cu2++SNP處理番茄葉片NOS活性增加37%。Cu2++SNP+Hb處理番茄葉片NOS活性比Cu2++SNP處理降低38.8%，差異顯著(圖8-A)。

Cu2+處理番茄根系NOS活性比CK提高62.4%，差異顯著。與Cu2+處理相比，Cu2++SNP處理番茄根系NOS活性提高56.8%，差異顯著。Cu2++SNP處理番茄根系NOS活性是CK的2.5倍，差異極顯著。Cu2++SNP+Hb處理番茄根系NOS活性比Cu2++SNP處理降低20.6%(圖8-B)，抵消了部分SNP的激發(fā)效應(yīng)。

圖7 外源NO對Cu2+毒害下番茄葉片(A)和根系(B)中NO釋放量的影響Fig. 7 Effects of exogenous NO on the production amout of NO in tomato leaves(A)and roots(B)under Cu2+ stress

圖8 外源NO對Cu2+毒害下番茄葉片(A)和根系(B)中NOS活性的影響Fig. 8 Effects of exogenous NO on the NOS activity in tomato leaves(A)and roots(B)under Cu2+ stress

2.8 外源NO對Cu2+脅迫下番茄精氨酸含量的影響

Cu2+處理下番茄葉片精氨酸含量比CK增加20.2%，差異顯著。與Cu2+處理相比，Cu2++SNP處理番茄葉片精氨酸含量增加83%，達(dá)極顯著水平。Cu2++SNP處理番茄葉片精氨酸含量為CK的2倍，差異顯著。與Cu2++SNP處理相比，Cu2++SNP+Hb處理番茄葉片精氨酸含量降低11%(圖9-A)。

與CK相比，Cu2+處理的番茄根系精氨酸含量提高54.5%，差異顯著。Cu2++SNP處理的番茄根系精氨酸含量比Cu2+處理增加78.5%，差異極顯著。Cu2++SNP處理番茄根系精氨酸含量增加為CK的2.8倍，差異極顯著。Cu2++SNP+Hb處理番茄根系精氨酸含量比Cu2++SNP降低24.6%，差異顯著(圖9-B)。

2.9 外源NO對Cu2+脅迫下番茄生物量的影響

由圖10-A可知，Cu2+處理下，番茄地上部分鮮重比CK減少39.1%，差異顯著。與Cu2+處理相比，Cu2++SNP處理地上部分鮮重增加26.5%，差異顯著。Cu2++SNP+Hb處理比Cu2++SNP處理地上部分鮮重減少19.6%，與CK相比，Cu2++SNP處理地上部分鮮重減少23%。

與CK相比，Cu2+處理根系鮮重減少48.8%，差異顯著。Cu2++SNP處理根系比Cu2+處理增加46.1%。與CK處理相比，Cu2++SNP處理根系鮮重減少26.27%。Cu2++ SNP +Hb處理比Cu2++SNP處理根系鮮重減少25.26%(圖10-B)。

圖9 外源NO對Cu2+毒害下番茄葉片(A)和根系(B)中精氨酸含量的影響Fig. 9 Effects of exogenous NO on the production amout of NO in tomato leaves and roots under Cu2+ stress

圖10 外源NO對Cu2+脅迫下番茄幼苗生物量的影響Fig. 10 Effect of exogenous NO on biomass in tomato seedlings under copper stress

3 討論(Discussion)

ROS主要以單線態(tài)氧(1O2)、超氧陰離子(O2-)、過氧化氫(H2O2)、羥基自由基(-OH)和氫過氧基(HO2·)5種形式相互轉(zhuǎn)換。很多研究表明，銅脅迫導(dǎo)致大量的活性氧自由基，如H2O2、O2-等在植物體內(nèi)積累，達(dá)到一定濃度時便會引起質(zhì)膜和細(xì)胞器膜的膜脂過氧化，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。而植物體自身會產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，即誘導(dǎo)植物體內(nèi)的酶促清除系統(tǒng)—抗氧化酶類，如CAT抗氧化系統(tǒng)的啟動，其可在一定程度上清除過多活性氧以維持機(jī)體自由基代謝平衡，緩解過多Cu2+脅迫對植物體的傷害。本研究中，過量Cu2+造成番茄體內(nèi)活性氧的積累，H2O2和O2-、MDA的含量顯著上升，而CAT活性下降，說明銅在此濃度下，會使CAT活性下降，高濃度銅對植物體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)有一定的破壞作用。

H2O2是植物體內(nèi)較為活躍的信號分子[19]。大量研究顯示，NO和H2O2可能是植物脅迫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的中心環(huán)節(jié)，介導(dǎo)多種信號途徑，二者共同參與調(diào)控氣孔運(yùn)動，促進(jìn)細(xì)胞編程性死亡以及誘導(dǎo)防御基因表達(dá)等過程。在細(xì)胞內(nèi)不同的NO和ROS自由基能發(fā)生直接的化學(xué)反應(yīng)而彼此相互轉(zhuǎn)換[20]。NO和H2O2均可跨膜運(yùn)輸，在許多情況下NO和H2O2之間相互聯(lián)系。例如由真菌激發(fā)子刺激而引起的H2O2和NO的形成過程，基本上是同步的。ROS是生物體氧化代謝的副產(chǎn)物，而NO則會通過調(diào)節(jié)ROS的生成和降解影響植物體內(nèi)ROS的水平和毒性，并通過參與胞內(nèi)氧化還原平衡的調(diào)節(jié)來降低植物過氧化傷害。大量研究表明，在外界環(huán)境刺激下，植物體內(nèi)NO與其它信號分子如H2O2，在生物合成、基因表達(dá)和蛋白活性調(diào)控水平上，存在串流作用[21]。NO可影響超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和抗壞血酸過氧化物酶(ASA-POD)的活性，進(jìn)而調(diào)節(jié)植物體內(nèi)源H2O2的含量。在一些生理過程中，NO和ROS具有相似的生物學(xué)特性。如引起胞質(zhì)Ca2+濃度升高、激活磷脂酶或蛋白激酶等，表明彼此可能存在相互關(guān)系。不同的非生物脅迫和刺激，如鹽脅迫、干旱脅迫、重金屬脅迫，都會誘導(dǎo)NO和H2O2的共同產(chǎn)生。Capone等[22]用NO或H2O2處理擬南芥根系，發(fā)現(xiàn)葉片中MAPK這類植物逆境傳遞信號分子的活性會迅速升高，表明NO與H2O2作為信號分子具有相似的信號傳遞作用。本研究中，外源NO供體的加入明顯降低H2O2、O2-和MDA的含量，提高了CAT的活性，這說明，NO可能通過其信號分子的作用，誘導(dǎo)CAT抗氧化酶系統(tǒng)啟動，對活性氧進(jìn)行及時的清除。試驗結(jié)果中，在對番茄進(jìn)行Cu2++SNP處理后，H2O2、O2-和MDA含量呈與對照組接近的趨勢，均有所下降，說明正常生長條件下，植物體內(nèi)需要H2O2等活性氧在一定濃度下參與特定的生理代謝活動，并且活性氧濃度可能與NO水平密切相關(guān)。植物體內(nèi)可能存在NO與活性氧的平衡體系，共同發(fā)揮信號分子的作用。植物體中包含多種NO合成酶源，包括黃嘌呤氧化還原酶，過氧物酶，細(xì)胞色素P450，和一些亞鐵血紅素蛋白。精氨酸不僅作為一種重要的氮素貯藏營養(yǎng)，還具有一些特殊生理功能[23]，可能與精氨酸代謝有關(guān)，即NO是精氨酸代謝產(chǎn)物之一。植物細(xì)胞內(nèi)，NO的產(chǎn)生途徑之一是一類以L-精氨酸為底物的類NOS。研究發(fā)現(xiàn)擬南芥中有一類與哺乳類NOS序列不相同的AtNOS1蛋白，在植物體中具有一套獨(dú)特的精氨酸依賴型NO合成機(jī)制。L-精氨酸是生成多胺和NO等的前體物質(zhì)，而多胺是與植物生長發(fā)育有直接關(guān)系的生物活性分子[24]。多胺和NO是參與植物發(fā)育和脅迫響應(yīng)的多功能信號分子，這表明L-精氨酸可能會通過精氨酸代謝途徑，在參與多胺和NO的生物合成平衡中扮演重要角色。本試驗發(fā)現(xiàn)，對番茄的不同處理，顯著影響了番茄NO釋放量，改變了NOS和NR活性，而對精氨酸含量影響不顯著，結(jié)果表明NOS和NR是NO合成途徑之一。精氨酸含量可能受精氨酸代謝途徑的影響而有所變化。

本試驗通過對番茄在銅脅迫及外源NO對其緩解性研究，表明過量的銅會對植物細(xì)胞產(chǎn)生過氧化傷害，外源NO的施入通過提高NOS和NR活性調(diào)節(jié)內(nèi)源NO代謝途徑，從而緩解這一脅迫。精氨酸代謝與內(nèi)源NO代謝緊密相關(guān)，NOS途徑和NR途徑間接與精氨酸合成有關(guān)。外源NO的施入對番茄植株內(nèi)精氨酸含量產(chǎn)生影響，但可能由于精氨酸酶對精氨酸合成的直接作用而表現(xiàn)不明顯。

[1] Wojcik M, Tukiendorf A. Response of wild type of Arabidopsis thaliana to copper stress [J]. Biologia Plantarum, 2003, 46: 79-83

[2] 秦毓茜, 李延紅. 一氧化氮在植物中的生理作用[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2006, 34(9): 1802-1804

Qin Y Q, Li Y H. Role of nitric oxide in plant [J]. Journal of Anhui Agricultural Sciences, 2006, 34(9): 1802-1804 (in Chinese)

[3] Weitzberg E, Lundberg J O N. Nonenzymatic nitric oxide production in humans [J]. Nitric Oxide. 1998, 2: 1-7

[4] 崔秀敏, 吳小賓, 李曉云, 等. 銅、鎘毒害對番茄生長和膜功能蛋白酶活性的影響及外源NO的緩解效應(yīng)[J]. 植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報, 2011, 17(2) : 349-357

Cui X M, Wu X B, Li X Y, et al. Responses of growth, functional enzyme activity in biomembrane of tomato seedlings to excessive copper, cadmium and the alleviating effect of exogenous nitric oxide [J]. Plant Nutrition and Fertilizer Science, 2011, 17(2): 349-357 (in Chinese)

[5] 張義凱, 崔秀敏, 楊守祥, 等. 外源NO對鎘脅迫下番茄活性氧代謝及光合特性的影響[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報, 2010, 21(6) : 1432-1438

Zhang Y K, Cui X M, Yang S X, et al. Effects of exogenous nitric oxide on active oxygen metabolism and photosynthetic characteristics of tomato seedlings under cadmium stress [J]. Chinese Journal of Applied Ecology, 2010, 21(6): 1432-1438 (in Chinese)

[6] 趙世杰, 史國安, 董新純. 植物生理學(xué)實驗指導(dǎo)[M]. 北京: 中國科學(xué)技術(shù)出版社, 2002: 42-43

Zhao S J, Shi G A, Dong X C. Plant physiology experiment instruction [M]. Beijing: China Science and Technology Press, 2002: 42-43 (in Chinese)

[7] Patterson B D, Mackae E A, Mackae I B. Estimation of hydrogen peroxide in plant extracts using titanium (IV) [J]. Analytical Chemistry, 1984, 139: 487-492

[8] Sakaguehi S. A new method for the colorimetric determination of arginine [J]. Journal of Biochemistry, 1950, 37: 231-236

[9] 胡桂娟, 劉寄明, 剃嘉芬. 化學(xué)法測定精氨酸總量[J]. 落葉果樹, 1995, 01: 22

Hu G J, Liu J M, Ti J F. Chemical method for determination of total arginine [J]. Deciduous Fruit, 1995, 01: 22 (in Chinese)

[10] Elstner E F, Heupel A. Inhibition of nitrite formation from hydroxylam inonium-chloride: A simple assay for superoxide dismutase [J]. Analytical Biochemistry, 1976, 70: 616-620

[11] Cakmak I, Marschner H. Magnesium deficiency and high light intensity enhance activities of superoxide dismutase, ascorbate peroxidase, and glutathione reductase in bean leaves [J]. Plant Physiology, 1992, 98: 1222-1227

[12] Murphy M E, Noack E. Nitric oxide assay using haemoglob in method [J]. Methods in Enzymology, 1994, 233: 240-250

[13] Neill S J, Desikan R, Hancock J T. Nitric oxide signaling in plants [J]. New Phytologist, 2003, 159: 11-35

[14] 史慶華, 賴齊賢, 朱祝軍, 等. 一氧化氮在植物中的生理功能[J]. 細(xì)胞生物學(xué)雜志, 2005, 01: 39-42

Shi Q H, Lai Q X, Zhu Z J, et al. Physiological function of nitric oxide in plant [J]. Chinese Journal of Cell Biology, 2005, 1: 39-42 (in Chinese)

[15] Mocquot B, Vangronsveld J, Clijsters H, Mench M. Copper toxicity in yong maize (Zea mays L) plants: Effects on growth, mineral and chlorophyll contents, and enzymes activities [J]. Plant and Soil, 1996, 182: 287-300

[16] Onzounidou G，Moustakas M，Lannoye R. Chlorophyll fluorescence and photoacoustic characteristics in relationship to changes in chlorophyll and Ca2+content of a Cu2+- tolerant Silene compacta ecotype under Cu2+treatment [J]. Physiol Plant, 1995, 93: 551-557

[17] Weitzberg E, Lundberg J O N. Nonenzymatic nitric oxide production in humans [J]. Nitric Oxide, 1998, 2: 1-7

[18] Bethke P C, Badger M R. Jones R L. Apoplastic synthesis of nitric oxide by plant tissues [J]. The Plant Cell, 2004, 16: 332-341

[19] 苗雨晨, 董發(fā)才, 宋純鵬. 過氧化氫—植物體內(nèi)的一種信號分子[J]. 生物學(xué)雜志, 2001, 02: 4-6

Miao Y C, Dong F C, Song C P. Hydrogen peroxide-signal molecular in plants [J]. Journal of Biology, 2001, 02: 4-6 (in Chinese)

[20] 楊洪強(qiáng), 高華君. 植物精氨酸及其代謝產(chǎn)物的生理功能[J]. 植物生理與分子生物學(xué)學(xué)報, 2007, 33(1): 1-8

Yang H Q, Gao H J. Physiological function of arginine and its metabolites in plants [J]. Journal of Plant Physiology and Molecular Biology, 2007, 33(1): 1-8 (in Chinese)

[21] Qiao W, Li C, Fan L M. Cross-talk between nitric oxide and hydrogen peroxide in plant responses to abiotic stresses [J]. Environmental and Experimental Botany, 2014, 100: 84-93

[22] Capone R, Tiwari B S, Lenine A. Rapid transmission of oxidative and nitrosative stress signals from roots to shoots in Arabidopsis [J]. Plant Physiology and Biochemistry, 2004, 42: 425-428.

[23] 高華君, 楊洪強(qiáng), 杜方嶺, 等. 平邑甜茶幼苗生長過程中精氨酸和一氧化氮水平的變化[J]. 植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報, 2008, 14(4): 774-778

Gao H J, Yang H Q, Du F L, et al. Changes in arginine and nitric oxide levels in hupehensis Rehd. Seedlings during plant development [J]. Plant Nutrition and Fertilizer Science, 2008, 14(4): 774-778 (in Chinese)

[24] Gao H J, Yang H Q, Wang J X. Arginine metabolism in roots and leaves of apple (MalusdomesticaBorkh.): The tissue-specific formation of both nitric oxide and polyamines [J]. Scientia Horticulturae, 2009, 119(2): 147-152

[25] Morris Jr S M. Recent advances in arginine metabolism [J]. Current Opinion in Clinical Nutrition & Metabolic Care, 2004, 7(1): 45-51

[26] 趙福庚, 劉友良. 大麥幼苗多胺合成比脯氨酸合成對鹽脅迫更敏感[J]. 植物生理學(xué)報, 2000, 26(4): 343-349

Zhao F G, Liu Y L. Synthesis of polyamine has more sensitivity than that of proline in barley seedling [J]. Acta Phytophysiologica Sinica, 2000, 26(4): 343-349 (in Chinese)

[27] Cheng L, Ma F, Ranwala D. Nitrogen storage and its interaction with carbohydrates of young apple trees in response to nitrogen supply [J]. Tree Physiol, 2004, 24: 91-98

[28] Modolo L V, Augusto O, Almeida I M G, et al. Decreased arginine and nitrite levels in nitrate reductase-deficient Arabidopsis thaliana plants impair nitric oxide synthesis and the hypersensitive response to Pseudomonas syringae [J]. Plant Science, 2006, 171(1): 34-40

[29] 張洪艷, 趙小明, 白雪芳, 等. 氮合成途徑研究進(jìn)展[J]. 西北植物學(xué)報, 2009, 29(7): 496-1506

Zhang H Y, Zhao X M, Bai X F, et al. Nitric oxide biosynthesis pathway in Plant [J]. Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica, 2009, 29(7): 1496-1506 (in Chinese)

[30] Todd C D, Gifford D J. Loblolly pine arginase responds to arginine in vitro [J]. Planta, 2003, 217: 610-615

◆

StudyontheMetabolismPathwayofROSandNOofTomatoSeedlingsMediatedbyExogenousNOunderCopperIonStress

Wang Yijun， Li Xiaoyun， Wang Jian， Cui Xiumin*

College of Resources and Environment, Shandong Agricultural University, National Engineering Laboratory for Efficient Utilization of Soil and Fertilizer Resources, Tai’an 271018, China

29 April 2014accepted20 June 2014

By using solution culture method, this study investigated the effects of exogenous nitric oxide on reactive oxygen and the metabolism of NO of tomato seedling. The results showed that under copper ion stress, the production rate of oxygen radical both in leaves and roots of tomato seedlings increased，while the production of NO, the activities of NR and NOS in tomato seedling reduced. The application of nitric oxide promoted the activity of NOS in leaves and roots and activity of NR in leaves, thus increased the production of NO. Meanwhile, the exogenous NO significantly affected arginine metabolism and led to an upward tendency of arginine. Under the Cu+SNP+Hb treatment, Hb (the scavenger of NO) could partly counteract the effect of exogenous NO, which made arginine decrease. In conclusion, adding exogenous NO could improve the production of NO through enzymatic and non-enzymatic pathway, which mediated the NO signal networks regulating the metabolic pathway among the NO, reactive oxygen and arginine metabolism so as to relieve oxidative damage caused by excessive copper ion.

tomato; copper stress; nitric oxide; ROS; arginine; NO metabolism

2014-04-29錄用日期：2014-06-20

1673-5897(2014)4-678-11

： X171.5

： A

崔秀敏(1977—)，女，博士，副教授，植物營養(yǎng)機(jī)理與調(diào)控。

國家自然科學(xué)基金項目(31201619)和泰安市科技發(fā)展計劃項目(32606)

王逸筠(1990-)，女，碩士研究生；研究方向：植物營養(yǎng)機(jī)理與調(diào)控；E-mail：leixiaolei1@163.com

*通訊作者(Corresponding author)，E-mail: xiumincui@sdau.edu.cn

10.7524/AJE.1673-5897.20140429001

王逸筠，李曉云，王 建，等. 外源NO介導(dǎo)Cu2+脅迫下番茄幼苗活性氧與內(nèi)源NO代謝的研究[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報, 2014, 9(4): 678-688

Wang Y J, Li X Y, Wang J, et al. Study on the metabolism pathway of ROS and NO of tomato seedlings mediated by exogenous NO under copper ion stress [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2014, 9(4): 678-688 (in Chinese)