金葡菌法制備Wistar大鼠脛骨骨髓炎骨缺損模型

劉玉新　張麗艷　滕學(xué)仁　欒艦

【摘要】 目的：研究將蘸有金黃色葡萄球菌懸液的棉條植入Wistar大鼠脛骨骨缺損中制備骨髓炎骨缺損標(biāo)本的方法。方法：將健康雄性Wistar大鼠30只按隨機(jī)數(shù)字表法分為三組，每組10只20個(gè)后腿標(biāo)本。第1組：在Wistar大鼠雙側(cè)脛骨近端制造骨缺損；第2組：將蘸有金黃色葡萄球菌懸液的棉條置入骨缺損中；第3組：應(yīng)用抗生素治療將蘸有金黃色葡萄球菌懸液的棉條置入骨缺損中的大鼠。比較各組大鼠創(chuàng)口愈合時(shí)間，并在7、14 d時(shí)觀(guān)察大鼠體重、體溫、傷口愈合、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、脛骨標(biāo)本及CR并進(jìn)行比較。結(jié)果：三組在體重、體溫、傷口愈合情況、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、脛骨標(biāo)本及CR表現(xiàn)積分上比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：在脛骨骨缺損中植入蘸有金黃色葡萄球菌懸液的棉條是制備Wistar大鼠脛骨骨髓炎骨缺損的良好方法。

【關(guān)鍵詞】 大鼠； 骨髓炎； 骨缺損

骨髓炎（Osteomyelitic bone defect，OBD）是一個(gè)由于微生物感染導(dǎo)致骨骼破壞的炎癥反應(yīng)過(guò)程。其治療對(duì)于醫(yī)護(hù)工作人員來(lái)說(shuō)也是非常棘手的，尤其慢性骨髓炎骨缺損，纏綿難愈，反復(fù)發(fā)作[1-5]。臨床上對(duì)OBD治療的研究很多，關(guān)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型量也很多，也發(fā)表了很多骨髓炎標(biāo)本制備的文章，然而未發(fā)現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)的Wistar大鼠骨髓炎骨缺損模型的制備流程[6-10]?；诖?，筆者本文介紹了一種制造Wistar大鼠骨髓炎骨缺損模型的簡(jiǎn)單實(shí)用的新方法。

1 材料與方法

1.1 試劑及動(dòng)物 金黃色葡萄球菌懸液：標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC25923），濃度：3×106 CFU；氯胺酮：0.1 g/2 mL；甲醛溶液：10%中性；Wistar健康雄性大鼠30只，開(kāi)始實(shí)驗(yàn)時(shí)6周齡，190～210 g，平均201 g。

1.2 方法 30只大鼠隨機(jī)分為三組，每組10只取雙側(cè)脛骨近端標(biāo)本共20個(gè)。將每只大鼠稱(chēng)重，腹部皮下注射氯胺酮（150 mg/kg）麻醉，以8% Na2S脫毛，生理鹽水沖洗干凈后，將大鼠仰臥位固定在手術(shù)臺(tái)上，碘伏消毒術(shù)區(qū)皮膚，鋪無(wú)菌洞巾，在膝關(guān)節(jié)下沿脛骨前脊內(nèi)側(cè)切開(kāi)長(zhǎng)約1.5 cm皮膚切口，在脛骨前肌內(nèi)側(cè)進(jìn)入達(dá)骨膜，顯露脛骨上端的前內(nèi)側(cè)面，在膝關(guān)節(jié)間隙下方1.5～2 mm向下以尖刀片切取骨前內(nèi)側(cè)面骨皮質(zhì)，將該骨皮質(zhì)片取出，造成成骨缺損。筆者所切取的皮質(zhì)骨片和脛骨近端內(nèi)側(cè)面形狀相關(guān)，皮質(zhì)骨片的縱徑為該骨片中點(diǎn)橫徑的2倍，長(zhǎng)度：7.0～8.5 mm，平均7.6 mm，骨片橫徑為該處脛骨前內(nèi)側(cè)面骨質(zhì)橫徑的0.8倍，長(zhǎng)度：3.5～4.3 mm，平均3.8 mm。取下皮質(zhì)骨片后，第1組：殘腔不做處理，分兩層縫合；第2、3組：將蘸有0.3 mL 3×106CFU的金葡菌棉條植入殘腔內(nèi)，并注射5%魚(yú)肝油酸鈉后，骨蠟封閉殘腔，創(chuàng)口分兩層縫合，不包扎。術(shù)后第7天時(shí)，觀(guān)察第1、2組的各項(xiàng)指標(biāo)。第3組，7 d后開(kāi)始肌注用頭孢呋辛100 mg/（kg·d），術(shù)后第14天時(shí)，觀(guān)察該組的各項(xiàng)指標(biāo)及第1組的體重指標(biāo)。

1.3 觀(guān)察指標(biāo) （1）體重：術(shù)后第7、14天時(shí)觀(guān)察三組的體重情況；（2）肛溫：實(shí)驗(yàn)時(shí)，當(dāng)天上午9點(diǎn)麻醉后，測(cè)量肛溫；（3）白細(xì)胞計(jì)數(shù)（WBC）：斷尾法取血；（4）肉眼觀(guān)察脛骨標(biāo)本：按照Rissing[11]評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行打分評(píng)定；（5）CR檢查：術(shù)后7 d，按照Smeltzer等[12]人制定的Smeltzer評(píng)分系統(tǒng)進(jìn)行評(píng)定分，總分為20分。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用 SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以（x±s）表示，比較采用單因素方差分析法及t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較采用 字2檢驗(yàn)，以P<0.05表示差異與統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組傷口愈合情況比較 傷口按照甲、乙、丙愈合標(biāo)準(zhǔn)評(píng)定，三組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且第1組甲級(jí)愈合與第2、3組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表1。

表1 三組創(chuàng)口愈合情況比較 個(gè)

組別 甲級(jí)愈合 乙級(jí)愈合 丙級(jí)愈合

第1組（n=20） 20* 0 0

第2組（n=20） 0 5 15

第3組（n=20） 0 11 9

*與第2、3組比較，P<0.05

2.2 三組體重比較 麻醉后，大鼠采用電光分析天平稱(chēng)重，7 d時(shí)，第1組的體重與第2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；14 d時(shí)，第1組的體重與第3組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表2。

表2 三組體重比較（x±s） g

組別 7 d 14 d

第1組（n=10） 210.6±10.8* 232.4±16.5△

第2組（n=10） 193.3±12.6 -

第3組（n=10） - 218.7±14.6

*與第2組比較，P<0.05；△與第3組比較，P<0.05

2.3 三組其他指標(biāo)的比較 三組的肛溫、WBC計(jì)數(shù)、Rissing評(píng)分、Smeltzer評(píng)分比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表3。肉眼觀(guān)察脛骨標(biāo)本情況：第1組無(wú)死骨及感染性炎癥反應(yīng)；第2組骨髓炎急性期（圖1、2）；第3組形成骨髓炎骨缺損模型（圖3、4）。

圖1 骨髓炎急性期膿腔形成

圖2 骨髓炎急性期

3 討論

目前，骨髓炎生物學(xué)模型的制作有Stefan法、Fitzgeraid法和Norden法等[13-15]。Stefan法是在Wister大白鼠股靜脈內(nèi)注入金黃色葡萄球菌液制作動(dòng)物脛骨骨髓炎模型，但是，該實(shí)驗(yàn)操作困難，效果不確切，成功率低。Fitzgeraid法是以兔脛骨為標(biāo)本，用金黃色葡萄球菌加骨水泥填入骨缺損，該法由于填充了骨水泥，不利于進(jìn)一步的手術(shù)操作處理。Norden法和Fitzgeraid法類(lèi)似，筆者在其基礎(chǔ)上加以改進(jìn)，在Wistar大鼠脛骨上段制造的骨缺損腔內(nèi)植入蘸有0.3 mL 3×106CFU金黃色葡萄球菌液的紗布，并腔內(nèi)注射5%魚(yú)肝油酸鈉后，以骨蠟封閉骨缺損口，成功制造出模型。術(shù)后7 d時(shí)，脛骨標(biāo)本顯示：第1組無(wú)死骨及感染性炎癥反應(yīng)，BD清晰存在，殘腔內(nèi)填充肉芽組織，邊緣骨膜收縮，髓腔未閉；CR未見(jiàn)死骨形成。第2組創(chuàng)口未愈合，局部發(fā)紅、腫脹，可觸及波動(dòng)感，或者竇道形成，創(chuàng)口內(nèi)有黃色黏稠膿液流出，骨缺損局部有骨膜反應(yīng)，殘留死腔；CR表現(xiàn)為脛骨上段出現(xiàn)軟組織腫脹陰影，膿腔形成（圖1）；脛骨局部有矩形缺損區(qū)，邊緣有骨溶解破壞，骨小梁排列紊亂，周?chē)窒扌怨琴|(zhì)疏松，邊緣骨密度增高。骨膜反應(yīng)、毛糙及不同程度增厚，為骨髓炎急性期（圖2）。第3組各種癥狀較急性期有所減輕，脛骨上段局部可見(jiàn)竇道、肉芽及瘢痕組織生成，有較稀薄膿液性滲出，殘腔周?chē)枨环忾]；CR見(jiàn)脛骨上端軟組織腫脹陰影減小，骨矩形缺損區(qū)邊緣骨硬化，周?chē)琴|(zhì)疏松，骨小梁排列紊亂，骨質(zhì)溶解破壞，骨膜反應(yīng)較急性期減輕，形成OBD模型（圖3、4）。

綜上所述，該法操作容易掌握，效果明確，為制造Wistar大鼠脛骨骨髓炎骨缺損模型的良好方法。

參考文獻(xiàn)

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（收稿日期：2014-03-26） （本文編輯：蔡元元）

綜上所述，該法操作容易掌握，效果明確，為制造Wistar大鼠脛骨骨髓炎骨缺損模型的良好方法。

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（收稿日期：2014-03-26） （本文編輯：蔡元元）

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（收稿日期：2014-03-26） （本文編輯：蔡元元）