福壽螺多糖免疫調(diào)節(jié)作用研究

趙東賢，胡命寶，王 軍

1.淮南聯(lián)合大學(xué)(安徽淮南232001)

2.淮南市第一人民醫(yī)院(安徽淮南232001)

福壽螺又名蘋果螺，產(chǎn)于南美洲亞馬遜河流域。屬軟體動(dòng)物門，瓶螺科，瓶螺屬，在我國資源極為豐富?，F(xiàn)代研究表明貝類多糖具有抗腫瘤，增強(qiáng)機(jī)體免疫力，抗衰老，抗病毒等功能［1］。前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)福壽螺多糖具有抗病毒生物學(xué)活性［2］，其作用機(jī)制可能與提高機(jī)體免疫力有關(guān)，而關(guān)于福壽螺多糖增強(qiáng)免疫活性的研究未見報(bào)道。本研究旨在系統(tǒng)探討了福壽螺多糖對(duì)小鼠免疫功能的影響，為福壽螺多糖藥用學(xué)價(jià)值的開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、藥品、試劑與儀器 昆明種標(biāo)準(zhǔn)小鼠，體質(zhì)量18～22 g，雌雄各半，安徽醫(yī)科大學(xué)提供(SPF級(jí)，許可證號(hào):SCXK(皖)2011－002)。福壽螺多糖由安徽理工大學(xué)病原微生物實(shí)驗(yàn)室提供，純度為91.4%;小牛血清，美國GIBCO公司;MTT檢測(cè)試劑盒，北京碧云天公司;刀豆蛋白A，Sigma公司;LDH測(cè)定試劑盒，南京建成生物工程研究所;其它試劑為國產(chǎn)分析純。AE－20型電子分析天平，瑞士Metller公司;721－w微機(jī)型分光光度計(jì)，上海第三分析儀器廠;CO2孵箱，三洋電機(jī)國際貿(mào)易有限公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠免疫臟器指數(shù)的測(cè)定 昆明種標(biāo)準(zhǔn)小鼠40只小鼠隨機(jī)分為4組(每組10只):蒸餾水對(duì)照組、福壽螺多糖低、中、高劑量組(50、100、200 mg/kg)。每天定時(shí)等體積灌胃1次，連續(xù)給藥30 d后，禁食2 h，稱量每只小鼠體質(zhì)量。頸椎脫臼處死，摘取胸腺和脾臟，吸干血跡，稱重，計(jì)算胸腺、脾臟指數(shù)［2］。

1.2.2 吞噬細(xì)胞吞噬功能檢測(cè) 動(dòng)物分組、給藥同1.2.1。實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，小鼠腹腔注入5%的雞紅細(xì)胞懸液0.5 mL/只，2 h后腹腔注射2 mL生理鹽水，將小鼠頸椎脫臼處死，輕揉小鼠腹部2 min，吸出腹腔液置于含肝素鈉的離心管混勻(同組小鼠腹腔液放入同一管中)。取0.1 mL涂片，每組重復(fù)做片5片。將載玻片置于37℃培養(yǎng)箱孵育30 min，漂洗去上清液和未粘附的細(xì)胞，自然干燥后瑞氏染色，油鏡下隨機(jī)觀察200個(gè)巨噬細(xì)胞，計(jì)數(shù)吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)，計(jì)算吞噬指數(shù)［3－4］。

1.2.3 免疫抑制小鼠血清溶血素水平的測(cè)定 取小鼠50只，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組(環(huán)磷酰胺)、福壽螺多糖低、中、高劑量組(每組10只)?？瞻捉M與模型組給予等體積蒸餾水，其他組給予多糖灌胃30d，并于第27、28、29d對(duì)小鼠(除空白對(duì)照組)腹腔注射環(huán)磷酰胺20mg/kg，在首次給藥第28 d各組小鼠均腹腔注射5%的雞紅細(xì)胞懸液0.2 mL致敏。末次給藥30 min后，眼眶取血，離心20 min取血清，用生理鹽水1∶50稀釋后取1 mL，與5%雞紅細(xì)胞混懸液0.5 mL和10%豚鼠補(bǔ)體0.5 mL混勻，37℃水浴30 min，冰水中止反應(yīng)10 min，離心取上清液于540 nm 處比色［5－6］。

1.2.4 小鼠淋巴細(xì)胞增殖 動(dòng)物分組、給藥同

1.2.1 ，無菌操作分別取小鼠脾臟、胸腺，過200目鋼絲篩網(wǎng)，制備單細(xì)胞懸液，離心10 min，Hank’s液洗滌，將細(xì)胞懸浮于1 mL的完全培養(yǎng)液中?；罴?xì)胞數(shù)在95%以上，細(xì)胞密度為5×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔0.1 mL，每組6復(fù)孔。每組3孔加10 μg/mL的 ConA 100 μL/孔為實(shí)驗(yàn)組，其余3孔加RPMI1640培養(yǎng)液100 μL/孔為對(duì)照組，置于含5%CO2，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h，加入5 mg/mL的MTT20μL。繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸去上清液，加入 DMSO100 μL/孔，振蕩 10 min，酶標(biāo)儀 570 nm 波長(zhǎng)測(cè)每孔OD值，算出吞噬細(xì)胞刺激指數(shù)［4－5］。刺激指數(shù)=實(shí)驗(yàn)孔OD均值/對(duì)照孔OD均值。

1.3 數(shù)據(jù)處理 采用 SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因子方差分析，對(duì)組間比較進(jìn)行t檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)形式表示，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)小鼠臟器指數(shù)、巨噬細(xì)胞吞噬作用的影響福壽螺高劑量組小鼠的脾臟指數(shù)明顯高于正常對(duì)照組(P＜0.05)。各劑量組小鼠胸腺指數(shù)與正常對(duì)照組小鼠胸腺指數(shù)相比無明顯差異性。中、高劑量組小鼠吞噬細(xì)胞的吞噬百分率、吞噬指數(shù)分別與對(duì)照組比較差異顯著(P＜0.05)。見表1。

表1 福壽螺多糖對(duì)小鼠臟器指數(shù)和吞噬細(xì)胞吞噬功能的影響(n=10(±s)

表1 福壽螺多糖對(duì)小鼠臟器指數(shù)和吞噬細(xì)胞吞噬功能的影響(n=10(±s)

注:與對(duì)照組比較，▲P ＜0.05，★P ＜0.01。

吞噬指數(shù)正常對(duì)照 —組別 劑量(mg/kg) 脾臟指數(shù)(mg/g) 胸腺指數(shù)(mg/g) 吞噬百分率(%)3.81 ±1.83 2.93 ± 0.59 25.82 ±2.13 0.35 ±0.05福壽螺多糖組 50 3.93 ±1.23 3.12 ±0.85 25.24 ±1.85 0.34 ±0.01福壽螺多糖組 100 4.08±0.56 2.96±1.27 30.12±3.41▲ 0.42±0.03▲福壽螺多糖組 200 4.53±2.11▲ 3.27 ±1.53 45.03±2.56★ 0.50±0.05★

2.2 對(duì)免疫抑制小鼠溶血素抗體水平及ConA誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的影響 模型組與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠溶血素吸光度明顯降低(P＜0.05)。福壽螺中、高劑量組小鼠溶血素吸光度A值與模型組相比差異性顯著(P＜0.05，P＜0.01)。福壽螺中、高劑量組ConA誘導(dǎo)的脾淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)與模型組相比有差異性(P＜0.05)。但各個(gè)劑量組對(duì)于ConA誘導(dǎo)的胸腺淋巴細(xì)胞增殖與模型組無明顯差異性。見表2。

表2 福壽螺多糖對(duì)小鼠血溶素抗體和淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的影響(n=10(±s)

表2 福壽螺多糖對(duì)小鼠血溶素抗體和淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的影響(n=10(±s)

注:與正常對(duì)照組比較，●P ＜0.05;與模型組比較▲P ＜0.05，★P ＜0.01。

脾淋巴細(xì)胞刺激指數(shù) 胸腺淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)正常對(duì)照組 —組別 劑量(mg/kg) 血清素水平(A值)0.23 ±0.01 1.09 ±0.03 1.01 ±0.02模型對(duì)照組 — 0.10±0.02● — —福壽螺多糖組 50 0.11 ±0.03 1.10 ±0.02 1.02 ±0.01福壽螺多糖組 100 0.16±0.02▲ 1.25±0.04● 1.01±0.03福壽螺多糖組 200 0.20±0.06★ 1.37±0.03●1.04 ±0.05

3 討論

機(jī)體的免疫系統(tǒng)由特異性免疫和非特異性免疫構(gòu)成。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示高劑量福壽螺多糖可提高小鼠脾臟指數(shù)，但各劑量組對(duì)胸腺指數(shù)影響不大。脾臟中有豐富的B淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，與體液免疫關(guān)系更為密切，其臟器指數(shù)可在一定程度上反映機(jī)體免疫功能的強(qiáng)弱。表1結(jié)果還顯示，中、高劑量的多糖均能顯著提高腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬百分率、吞噬指數(shù)，且200 mg/kg濃度時(shí)增強(qiáng)作用達(dá)到極顯著的水平(P＜0.01)，而單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)是機(jī)體非特異性免疫系統(tǒng)的重要組成部分，具有吞噬和殺傷病原微生物、處理提呈抗原、分泌細(xì)胞因子的能力。表2結(jié)果顯示，模型組與對(duì)照組比較，血清素水平明顯降低，說明造模成功，模型組與多糖組比較，中、高劑量多糖組對(duì)免疫抑制小鼠血溶素水平有明顯修復(fù)作用，尤其高劑量多糖組溶血素抗體水平修復(fù)接近于正常組。表明多糖能顯著提高免疫抑制小鼠的免疫功能。研究結(jié)果還顯示福壽螺多糖對(duì)脾淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)呈現(xiàn)上拋物線形式的增強(qiáng)，其中100 mg/kg、200 mg/kg濃度時(shí)增強(qiáng)作用達(dá)顯著水平(P＜0.05)，表明多糖灌胃30 d后，增加小鼠體內(nèi)輔助性T細(xì)胞和誘導(dǎo)性T細(xì)胞數(shù)量，同時(shí)減少了抑制性 T細(xì)胞的數(shù)量、減弱其功能，從而使小鼠的免疫應(yīng)答反應(yīng)增強(qiáng)。由此可見，多糖對(duì)機(jī)體的免疫功能的增強(qiáng)作用與其提高小鼠脾臟指數(shù)、腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬能力、有效激活免疫細(xì)胞、促進(jìn)相關(guān)細(xì)胞因子的分泌有關(guān)。說明在增強(qiáng)機(jī)體免疫功效方面，福壽螺多糖具有廣闊的開發(fā)前景。

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