應(yīng)用MGB探針檢測(cè)人丙型肝炎病毒的基因型

陳澤惠，李欣鈺，肖湘文，丁 渭，劉淑園，陳華云*

1.云夢(mèng)縣人民醫(yī)院輸血科(湖北云夢(mèng)432500)

2.中山大學(xué)達(dá)安基因診斷中心(廣東 廣州510120)

丙型肝炎病毒(HCV)是具有高度的多樣性、異源性及非均一性變異特點(diǎn)的RNA病毒［1］，可經(jīng)血液傳播引起肝臟病變，是造成慢性肝炎、肝硬化、原發(fā)性肝癌［2］的主要原因。由于該病毒基因組序列的高度變異性致使HCV分為6個(gè)基因型及多種不同的亞型［3］，且 HCV 基因型具有區(qū)域分布特征［4］。有研究報(bào)道，人類(lèi)感染HCV后的臨床病程及治療效應(yīng)與其基因型之間存在一定的相關(guān)性，因此，對(duì)HCV感染者的血清或血漿先進(jìn)行分型分析，能為臨床治療起到重要的指導(dǎo)作用［5－6］，也對(duì)疫苗的研制提供重要的參考。本研究利用MGB探針的實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系對(duì)HCV病毒進(jìn)行基因分型的檢測(cè)，并對(duì)該檢測(cè)體系進(jìn)行了敏感性、重復(fù)性、特異性等方法學(xué)評(píng)價(jià)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 樣本 乙型肝炎病毒樣本、艾滋病毒樣本、EB病毒樣本、人類(lèi)皰疹病毒樣本等來(lái)自廣州地區(qū)醫(yī)院。檢測(cè)對(duì)象為700例陽(yáng)性樣本，分別為來(lái)自湖北省人民醫(yī)院、北京302醫(yī)院、北京地壇醫(yī)院、昆明3院四家醫(yī)院搜集的血清或血漿樣本，及廣州地區(qū)醫(yī)院250例體檢者的血液樣本。

1.2 試劑和儀器 RNA提取試劑盒采用中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司的核酸提取試劑盒(離心柱法)，PCR buffer、熱啟動(dòng) Taq酶、C－MLV 酶等為達(dá)安公司提供，dNTP、RNasin抑制劑、T載體試劑盒、T4連接酶試劑盒購(gòu)自Promega。實(shí)驗(yàn)儀器為ABI 9700 PCR儀、ABI 7500熒光定量PCR儀。

1.3 引物及探針設(shè)計(jì) 根據(jù)NCBI中HCV的基因組序列，選取HCV基因組中型特異性堿基的聚集區(qū)域?yàn)榘袇^(qū)域，在此區(qū)域內(nèi)應(yīng)用Primer5.0設(shè)計(jì)特異的引物及探針以區(qū)分不同的型別，探針5’報(bào)告基團(tuán)分別用FAM標(biāo)記、Yellow標(biāo)記、TexasRed標(biāo)記，3’熒光淬滅基團(tuán)用Eclipse標(biāo)記。引物及探針由達(dá)安和生工合成。引物及探針序列如表1所示。

1.4 樣本提取 采用中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司核酸提取試劑盒(離心柱法)從200 μL血清或血漿中提取病毒RNA，具體的提取操作步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。提取得到的RNA，－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng) 將HCV的8個(gè)基因型分為A管、B管、C管，其中A反應(yīng)管包括2a型、3b型及內(nèi)標(biāo);B反應(yīng)管包括1b型、1a型、2b型;C反應(yīng)管包括6a型、3a型、6v型。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 的反應(yīng)體系共 50 μL，其中 RNA 模板 20 μL，HCV 分型酶系3μL，5×PCR buffer 10μL，HCV 不同型別的引物及探針混合物6 μL，滅菌水11 μL。反應(yīng)條件為:50℃15 min(RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA);95℃15 min(滅活逆轉(zhuǎn)錄酶及激活熱啟動(dòng)Taq酶);94℃變性15 s，58℃45 s(收集熒光)，共45個(gè)循環(huán)。PCR反應(yīng)在ABI 7500熒光定量PCR儀上進(jìn)行。

表1 HCV基因分型引物及探針序列

1.6 陽(yáng)性質(zhì)控品的制備 首先對(duì)各型別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，而后進(jìn)行基因克隆，將克隆正確的菌液，提取質(zhì)粒后制作病毒樣顆粒，測(cè)序均由上海英俊公司完成。

1.7 特異性檢測(cè) 采用核酸提取試劑盒(離心柱法)提取的乙型肝炎病毒、艾滋病毒、EB病毒、人類(lèi)皰疹病毒等樣本中的病毒核酸，利用熒光定量PCR－MGB探針基因分型檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。

1.8 靈敏度檢測(cè) 將各型別的病毒樣顆粒梯度稀釋?zhuān)總€(gè)濃度分別檢測(cè)10次，檢測(cè)結(jié)果與HCV國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比較，確定試劑盒的靈敏度。

1.9 臨床樣本的檢測(cè) 將700例陽(yáng)性樣本和250例體檢者的血液樣本進(jìn)行MGB探針?lè)ǖ臒晒舛縋CR基因分型檢測(cè)，對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 陽(yáng)性質(zhì)控品構(gòu)建結(jié)果 首先對(duì)各型別的PCR產(chǎn)物進(jìn)行基因克隆，克隆測(cè)序結(jié)果正確后進(jìn)行病毒樣顆粒表達(dá)載體的構(gòu)建，而后將重組的病毒樣顆粒的測(cè)序結(jié)果與NCBI中的基因序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果正確。對(duì)測(cè)序正確的重組病毒樣顆粒進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)成功，表明陽(yáng)性質(zhì)控品構(gòu)建成功。

2.2 特異性檢測(cè) 將提取的乙型肝炎病毒、艾滋病毒、EB病毒、人類(lèi)皰疹病毒等樣本中的病毒核酸利用MGB探針的熒光定量PCR體系進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果全部為陰性，無(wú)擴(kuò)增曲線，僅陽(yáng)性質(zhì)控品產(chǎn)生相應(yīng)型別的擴(kuò)增曲線。

2.3 靈敏度檢測(cè)結(jié)果 將陽(yáng)性質(zhì)控品與HCV國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行梯度稀釋后，應(yīng)用MGB探針的熒光定量PCR基因分型體系進(jìn)行擴(kuò)增，通過(guò)與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行對(duì)比，確定本試劑盒的靈敏度為100 IU/mL，Ct值位于35～37范圍內(nèi)。(陽(yáng)性質(zhì)控品擴(kuò)增曲線如圖1所示)。

圖1 陽(yáng)性質(zhì)控品梯度擴(kuò)增曲線

2.4 臨床樣本檢測(cè)結(jié)果 250例體檢者血液中檢測(cè)到陽(yáng)性病例8例，將8例陽(yáng)性樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增后測(cè)序，結(jié)果全為陽(yáng)性。已知的700例陽(yáng)性樣本經(jīng)MGB探針的熒光定量PCR體系檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果全為陽(yáng)性，基因型大多數(shù)為1b型、2a型和3b型，少量的3a型和6a型，極少量的1a型和6v型。臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示，本試劑盒的靈敏度為100%，特異性為99.42%，粗一致性為99.73%，對(duì)血清和血漿兩種類(lèi)型樣本檢測(cè)結(jié)果無(wú)差異。

3 討論

有研究報(bào)道，HCV基因型分布不僅具有地域特性［7］，而且感染不同的基因型，可能導(dǎo)致臨床特征存在差異，因此HCV基因型是分析肝細(xì)胞癌患者的病因的重要因素。本研究以HCV 2a型、3b型、1b型、1a型、2b型、6a型、3a型、6v型 7個(gè)常見(jiàn)亞型為研究對(duì)象，采用MGB探針的熒光定量PCR體系對(duì)血液或血清及血漿中的HCV病毒進(jìn)行初步的型別檢測(cè)，輔助臨床進(jìn)行初步診斷，為找到快速的治療方案及尋找HCV的傳播途徑提供幫助，也為病原體的來(lái)源提供依據(jù)，因此對(duì)HCV基因型的研究十分重要。

目前研究HCV基因分型的方法常用的有引物特異性電泳分型法、分管引物測(cè)序法、HPLC酶切法、熔點(diǎn)曲線法、熒光PCR法等，這些傳統(tǒng)的方法操作步驟復(fù)雜，耗時(shí)較長(zhǎng)，而且結(jié)果不穩(wěn)定。為了快速準(zhǔn)確的對(duì)HCV病毒進(jìn)行基因型的確定，本研究采用MGB探針的熒光定量PCR體系進(jìn)行檢測(cè)。MGB探針具有以下優(yōu)點(diǎn):(1)序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單;(2)可以提高序列的Tm值，并可準(zhǔn)確預(yù)測(cè)Tm值;(3)高靈敏度，可以較早偵測(cè)到熒光信號(hào);(4)更快速辨識(shí)目標(biāo)序列;(5)高特異性，而且適用于多種反應(yīng)體系等。由于MGB探針的諸多優(yōu)點(diǎn)，因此可以提高HCV病毒基因分型時(shí)的準(zhǔn)確度、特異性和靈敏度等。相對(duì)于傳統(tǒng)的熒光定量PCR方法，MGB探針的熒光定量PCR方法在檢測(cè)HCV RNA病毒時(shí)靈敏度可達(dá)到100 IU/mL。

綜上所述，在檢測(cè)病毒基因型方面，熒光定量PCR法是重要的檢測(cè)方法，且此方法的檢測(cè)結(jié)果在對(duì)病毒進(jìn)行初步分析時(shí)也具有一定的意義。本研究通過(guò)利用MGB探針的熒光定量PCR檢測(cè)體系對(duì)HCV病毒進(jìn)行檢測(cè)，大大提高了熒光定量PCR法在檢測(cè)HCV病毒時(shí)的靈敏度和效率，并且可以方便快速的檢測(cè)HCV病毒的基因型，為以后研究HCV的發(fā)病機(jī)理和治療提供有益的幫助。

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