尼可地爾對(duì)氣道平滑肌細(xì)胞增殖表達(dá)及Th1/Th2免疫失衡的影響

鄧 伊，王志強(qiáng)

三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院(湖北宜昌443002)

氣道平滑肌細(xì)胞(ASMCs)增殖是導(dǎo)致哮喘氣道重構(gòu)的重要原因，但氣道重塑的發(fā)生機(jī)制迄今尚未完全闡明［1］。氣道重塑是與氣道炎癥伴行發(fā)生的，在哮喘發(fā)生過(guò)程中，Th1/Th2處于失衡狀態(tài)，Th2類細(xì)胞因子表達(dá)功能增強(qiáng)，Th1類細(xì)胞因子相對(duì)受抑制［2］。有研究證實(shí)，ATP敏感性鉀通道開(kāi)放劑能糾正哮喘的氣道重塑［3］，但其機(jī)制是否與ASMCs增殖有關(guān)，并未有系統(tǒng)性的報(bào)道。本課題在體外建立增殖型ASMCs與淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)模型的基礎(chǔ)上，探索KATP通道開(kāi)放劑尼可地爾是否具有逆轉(zhuǎn)ASMCs增殖和Th1/Th2免疫失衡的作用，為更有效的治療哮喘等免疫失衡疾病提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 SPF級(jí)SD雄性大鼠，年齡3～5周，體質(zhì)量100～140 g，由三峽大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供;Ⅰ型膠原酶(collageneⅠ)、血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)、格列本脲(Glibenclamide)，均購(gòu)自Sigma公司;尼可地爾(Nicorandil):日本 Tohoku Nipro醫(yī)藥公司;地塞米松(Dexamethasone)注射液:浙江仙據(jù)制藥股份有限公司;高糖DMEM培養(yǎng)基，美國(guó)Gbico BRL公司;α－SMA單抗，Boster;熒光(Cy3)標(biāo)記羊抗小鼠IgG、β－actin抗體、HRP標(biāo)記羊抗兔二抗，武漢博士德生物工程有限公司;BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、淋巴細(xì)胞分離液，碧云天;大鼠 TGF－β1ELISA試劑盒，伊萊瑞特生物科技有限公司;FITC conjugated(INF－alpha)、FITC conjugated(IL－4)，Santa cruz生物技術(shù)公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定 參考文獻(xiàn)［4］的方法并加以改進(jìn)，大鼠用腹腔注射10%的水合氯醛(0.4 mL/100 g)0.6 mL麻醉;超凈臺(tái)中手術(shù)取出氣管，刮去外膜內(nèi)膜，D－Hank's液洗凈，剪碎組織呈1 mm×1 mm×1 mm大小，Ⅰ型膠原酶37℃消化60 min。終止消化，用20%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，37℃5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，一周左右見(jiàn)細(xì)胞從組織塊周圍爬出。細(xì)胞傳代3－6代狀態(tài)穩(wěn)定，α－SMA免疫熒光染色鑒定ASMCs。

1.2.2 AngⅡ誘導(dǎo) ASMCs的增殖與表達(dá) AngⅡ(100nM)處理ASMCs，24 h換一次液，連續(xù)作用3 d;Western blotting檢測(cè)ASMCs上α－SMA的增殖:一抗為α－SMA，二抗為HRP標(biāo)記羊抗兔;ELISA檢測(cè)上清中TGF－β1分泌表達(dá)(按說(shuō)明書(shū)操作)。

1.2.3 AngⅡ作用后的ASMCs與淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)AngⅡ處理過(guò)的ASMCs，D－Hank`s液洗3遍，消化重懸后以1×106鋪于6孔板中，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)24 h后，加入淋巴細(xì)胞分離液提取的2 mL T淋巴細(xì)胞1×105，作用36 h。

1.2.4 流式細(xì)胞表面抗原檢測(cè)Th1/Th1分化差異收集各組T細(xì)胞于15 mL離心管中，1000 rpm，5 min離心2次，去上清，PBS重懸細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)(2×106cell/ml);在EP管中加入50 μL稀釋后的熒光標(biāo)記一抗，在陰性同型對(duì)照管加入50 μL PBS，每管中加入50 μLPBS重懸后的細(xì)胞(1×106cell)，并輕輕混勻;避光冰浴20 min;每管加入1.4 mL PBS，輕輕混勻，1000 rpm，5 min離心;避光室溫孵育10 min去上清，PBS重懸細(xì)胞，每管加入1.5 mL PBS，輕輕混勻，1000 rpm，5 min離心，重復(fù)3次;去上清，每管加入500 μL PBS重懸細(xì)胞流式儀檢測(cè);分別得到表達(dá)IFN－γ、IL－4的CD4+T細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)，即Th1和Th2細(xì)胞的相對(duì)百分率。

1.2.5 KATP通道開(kāi)放劑處理細(xì)胞 開(kāi)放劑(NCR)處理ASMCs以及共培養(yǎng)組細(xì)胞，并以治療藥(DEX)和拮抗劑(GLI)分別作為陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。藥物濃度分別是:NCR100 μmol/L，DEX100nM，GLI200 μmol/L，藥物處理后培養(yǎng)36 h每12 h換一次液。ELISA檢測(cè)上清中TGF－β1分泌表達(dá);流式細(xì)胞表面抗原檢測(cè)各組Th1/Th1分化差異。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(((±s)表示，經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)后，采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ASMCs鑒定 在倒置顯微鏡下觀察，ASMCs細(xì)胞形態(tài)明顯呈梭形，圓形的細(xì)胞核位于細(xì)胞中央，部分細(xì)胞團(tuán)生長(zhǎng)至融合，呈束狀平行排列，出現(xiàn)典型的“峰”和“谷”的生長(zhǎng)狀(圖1)。α－SMA免疫熒光染色，細(xì)胞被染呈紅色，95%以上的細(xì)胞α－actin染色為陽(yáng)性，證明所培養(yǎng)的細(xì)胞為平滑肌細(xì)胞(圖2)。

圖1 ASMCs鏡下觀察(×200)

2.2 AngⅡ誘導(dǎo)ASMCs的增殖與表達(dá)

2.2.1 檢測(cè)ASMCs上特有的α－肌動(dòng)蛋白(α－SMA)的表達(dá)量，即可得到ASMCs的增殖量。由圖3可知，與對(duì)照 ASMCs組相比，AngⅡ處理 ASMCs后可使細(xì)胞增殖。

圖2 ASMCs免疫熒光染色α－SMA(×400)

圖3 AngⅡ處理ASMCs前后α－SMA表達(dá)差異

2.2.2 AngⅡ處理前后 ASMCs表達(dá) TGF－β1的差異 ELISA檢測(cè)得到TGF－β1(pg/mL)平均濃度:AngⅡ·ASMCs組為(230.761±5.61)，ASMCs組為(141.026±5.10)。與對(duì)照 ASMCs組相比，AngⅡ處理后TGF－β1的表達(dá)水平明顯升高(P＜0.01)。

2.3 檢測(cè)共培養(yǎng)體系中Th1/Th1分化差異 與對(duì)照L組相比，ASMCs+L組和AngⅡ·ASMCs+L組中表達(dá)IFN－γ的CD4+T細(xì)胞百分率減低(P＜0.05)，表達(dá)IL－4的CD4+T細(xì)胞百分率增高(P＜0.05);AngⅡ·ASMCs+L組與ASMCs+L組相比有明顯差異(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組表達(dá)IFN－γ與IL－4的CD4+T細(xì)胞的百分率比較(±s，n=3)

表1 各組表達(dá)IFN－γ與IL－4的CD4+T細(xì)胞的百分率比較(±s，n=3)

注:與 L 組比較，*P ＜0.05;與 ASMCs+L組比較，#P ＜0.05。

?

2.4 藥物作用后ELISA檢測(cè)TGF－β1的表達(dá)差異與拮抗劑GLI對(duì)照組相比，DEX和NCR作用于細(xì)胞后ASMCs表達(dá)TGF－β1表達(dá)明顯減少(P＜0.05);AngⅡ處理ASMCs后分泌表達(dá)TGF－β1明顯增加(P＜0.01)。見(jiàn)表2。

表2 檢測(cè)上清中的TGF－β1表達(dá)差異(±s，n=3)

表2 檢測(cè)上清中的TGF－β1表達(dá)差異(±s，n=3)

注:與 GLI對(duì)照組比較，*P ＜0.05;與 ASMC組比較，#P ＜0.05。

拮抗劑(GLI) 治療藥(DEX) 開(kāi)放劑(NCR)ASMCs組 420.427 ±1.397 119.849 ±6.165* 176.930 ±2.844*ASMCs+L 組 402.408 ±6.680 93.431 ±3.745* 147.440 ±4.797*AngⅡ·ASMCs組 647.014 ±2.406# 350.133 ±1.683*# 374.168 ±6.043*#AngⅡ·ASMCs+L 組 617.207 ±7.011# 319.829 ±6.025*# 338.430 ±6.729*#

2.5 藥物作用后共培養(yǎng)體系中Th1和Th2的表達(dá)差異 與GLI對(duì)照組相比，DEX和NCR作用共培養(yǎng)體系后，表達(dá)IFN－γ的CD4+T細(xì)胞百分率相對(duì)增高(P＜0.05)，表達(dá)IL－4的CD4+T細(xì)胞百分率相對(duì)減低(P＜0.05)。見(jiàn)表3。

表3 (開(kāi)放劑對(duì)IFN－γ與IL－4的CD4+T細(xì)胞的百分率作用((±s，n=3)

表3 (開(kāi)放劑對(duì)IFN－γ與IL－4的CD4+T細(xì)胞的百分率作用((±s，n=3)

注:與本組 GLI相比，*P ＜0.05。

+GLI 35.19 ±3.02 22.88 ±2.74 ASMCs+L 組 +DEX 49.55 ±3.50*12.45 ±2.02*ASMCs+L 組 +NCR 42.90 ±3.23*15.81 ±1.99*AngⅡ·ASMCs+L 組 +GLI 22.72±2.42 32.75 ±2.77 AngⅡ·ASMCs+L 組 +DEX 36.51±3.18*22.74 ±2.48*AngⅡ·ASMCs+L 組 +NCR 33.73±3.33*23.24 ±2.26 IL－4 ASMCs+L組組 別 IFN－γ*

3 討論

氣道重塑廣義上是指氣道在慢性炎癥刺激下所發(fā)生的細(xì)胞損傷修復(fù)過(guò)程，哮喘反復(fù)發(fā)作可引起氣道重塑，導(dǎo)致不可逆性氣流受限及持續(xù)性非特異性支氣管高反應(yīng)。氣道重塑也是導(dǎo)致常規(guī)糖皮質(zhì)激素治療手段對(duì)慢性哮喘患者無(wú)效的重要原因之一［5］。ASMCs作為氣道主要的結(jié)構(gòu)細(xì)胞，其異常增殖與氣道高反應(yīng)性和哮喘嚴(yán)重程度密切相關(guān)，特別是在氣道重塑中起到十分重要的作用［6］。增殖的ASMCs使氣道壁增厚，導(dǎo)致不可逆性氣流受限的發(fā)生。因此，有效遏制ASMCs過(guò)度增殖，是治療難治性哮喘的根本途徑之一［7］。ASMCs表型可分收縮型和增殖/合成型，前者無(wú)增殖和遷移能力，對(duì)外界刺激產(chǎn)生收縮反應(yīng)，后者能夠分泌表達(dá)多種活性物質(zhì)，具有增殖、遷移的能力［8］。本研究采用 AngⅡ誘導(dǎo)ASMCs使之轉(zhuǎn)化為增殖型，以體外建立增殖型ASMCs與淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)模型為基礎(chǔ)。檢測(cè)結(jié)果顯示，ASMCs分泌表達(dá)TGF－β1的水平與 ASMCs的增殖程度呈正相關(guān);ASMCs的增殖和淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)體系中，增殖型ASMCs可以調(diào)節(jié)CD4+T細(xì)胞免疫平衡，分泌IL－4的CD4+T細(xì)胞比例升高，分泌IFN－γ的CD4+T細(xì)胞比例降低。INF－γ、IL－4分別為T(mén)h1和Th2細(xì)胞特征性細(xì)胞因子，說(shuō)明哮喘發(fā)生過(guò)程中Th2細(xì)胞與炎癥反應(yīng)正相關(guān)，而Th1細(xì)胞則呈負(fù)相關(guān);氣道重塑有可能通過(guò)ASMCs的增殖而提高TGF－β1等炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)，促進(jìn)炎癥反應(yīng)和免疫失衡的發(fā)展，從而達(dá)到加劇氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性的作用。

氣道平滑肌上存在多種鉀通道，ATP敏感性鉀通道是其中重要的一種。開(kāi)放該通道，K+外流，膜電位升高，細(xì)胞膜超極化，Ca2+內(nèi)流減少，可有效舒張平滑肌，從而降壓解痙［9］。因此，KATP通道是多種疾病的一個(gè)治療靶點(diǎn)。本研究采用KATP通道開(kāi)放劑尼可地爾處理ASMCs以及共培養(yǎng)組細(xì)胞，并以地塞米松和格列本脲分別作為陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。結(jié)果顯示，開(kāi)放劑尼可地爾與治療藥物地塞米松有類似的效果，都可抑制 ASMCs的增殖和TGF－β1表達(dá)，與拮抗劑有明顯的差異;同時(shí)，二者又可抑制IL－4相關(guān)Th1細(xì)胞的分化，而促進(jìn) IFN－γ相關(guān)Th1細(xì)胞的分化，從而逆轉(zhuǎn)Th1/Th2免疫失衡。

Th1主要分泌INF－γ、TNF－β、IL－12、IL－2等，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化，參與細(xì)胞免疫應(yīng)答及遲發(fā)性超敏反應(yīng)性炎癥發(fā)生;Th2主要分泌IL－13、IL－10、IL－6、IL－5、IL －4 等細(xì)胞子，促進(jìn)肥大細(xì)胞及EOS的分化，誘導(dǎo)免疫球蛋白(IgE)的產(chǎn)生，參與體液免疫應(yīng)答及速發(fā)型超敏反應(yīng)［10］。研究發(fā)現(xiàn)，Th2優(yōu)勢(shì)是哮喘形成及發(fā)展的關(guān)鍵機(jī)制，但哮喘的表現(xiàn)型并非由Th2細(xì)胞數(shù)量的單獨(dú)性升高決定，而是由于Th1/Th2比例關(guān)系趨向于Th2占優(yōu)勢(shì)［11］。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)TGF－β1對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和免疫功能都有重要的調(diào)節(jié)作用。許多種結(jié)構(gòu)細(xì)胞或免疫細(xì)胞都能產(chǎn)生TGF－β1如ASMCs，其在哮喘發(fā)生發(fā)展過(guò)程中氣道重要的作用。首先，TGF－β1具有促膠原產(chǎn)生、細(xì)胞外基質(zhì)沉積和誘導(dǎo)上皮細(xì)胞凋亡等的重要作用;其次，還具有促進(jìn)ASMCs增殖肥大的作用，從而產(chǎn)生導(dǎo)致管腔狹窄和不可逆性氣道功能改變等一系列不良后果;再次，TGF－β1還參與免疫反應(yīng)，抑制細(xì)胞因子如 IFN－γ和 TNF－α的產(chǎn)生［12］。因此，TGF－β1是哮喘氣道重塑重要的細(xì)胞因子，抑制TGF－β1的分泌或阻斷其在哮喘中的作用，有可能達(dá)到抑制氣道重塑的目的，這為哮喘的治療提供了新靶點(diǎn)和新方法。

因此，認(rèn)為尼可地爾可能是通過(guò)抑制ASMCs的增殖分泌表達(dá)TGF－β1炎癥相關(guān)因子，從而調(diào)節(jié)Th1/Th2的免疫平衡而產(chǎn)生治療作用。Th1/Th2的差異表達(dá)調(diào)節(jié)機(jī)制目前尚不清楚，深入研究TGF－β1與Th1/Th2平衡紊亂的關(guān)系，可進(jìn)一步探討哮喘的免疫發(fā)病機(jī)制，并可望為臨床對(duì)哮喘的預(yù)防和治療提供新的思路和新型的治療藥物。

［1］ Prakash YS.Airway smooth muscle in airway reactivity and remodeling:what have we learned?［J］.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2013，305(12):L912 －33.

［2］ 王志強(qiáng)，李杰，周鑫.尼可地爾對(duì)哮喘大鼠氣道反應(yīng)性和肺組織T－bet/GATA－3表達(dá)的影響［J］.湖北民族學(xué)院學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2013，30(2):20－22.

［3］ Wan X，Zhao J，Xie J.Effects of mitochondrial ATP －sensitive K(+)channel on protein kinase C pathway and airway smooth muscle cell proliferation in asthma［J］.JHuazhong Univ Sci Technolog Med Sci，2012，32(4):480－4.

［4］ 邱晨，李娜.平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)方法探討［J］.廣東醫(yī)學(xué)，2008，29(11):1791－1793.

［5］ Hirota N，Martin JG.Mechanisms of airway remodeling［J］.Chest，2013，144(3):1026－32.

［6］ Damera G，Tliba，Penattieri RA Jr，Airway smooth muscle as an immunomdulatory cell［J］.Pulm Pharmacol Ther，2009，2(2):353－359.

［7］ Xia YC，Redhu NS，Moir LM，et al.Pro－inflammatory and immunomodulatory functions of airway smooth muscle:emerging concepts［J］.Pulm Pharmacol Ther，2013，26(1):64－74.

［8］ Hirota JA，Nguyen TT，Schaafsma D，et al.Airway smooth muscle in asthma:phenotye plasticity and fanction［J］.Pulm Pharmacol Ther，2009，2(2):370－378.

［9］ Malerba M，Radaeli A，Mancuso S，et al.The potential therapeutic role of potassium channel modulators in asthma and chronic obstructive pulmonary disease［J］.J Biol Regul Homeost Agents，2010，24(2):123－130.

［10］ Shi YH1，Shi GC，Wan HY，et al.Coexistence of Th1/Th2 and Th17/Treg imbalances in patients with allergic asthma［J］.Chin Med J(Engl)，2011，124(13):1951－1956.

［11］ Deo SS，Mistry KJ，Kakade AM，et al.Role played by Th2 type cytokines in IgE mediated allergy and asthma［J］.Lung India，2010，27(2):66－71.

［12］ Bossé Y1，Stankova J，Rola－Pleszczynski M.Transforming growth factor－beta1 in asthmatic airway smooth muscle enlargement:is fibroblast growth factor－2 required［J］.Clin Exp Allergy，2010，40(5):710－724.