大鼠腦出血后蛋白酶激活受體－1與細(xì)胞凋亡關(guān)系的實(shí)驗(yàn)研究＊

張德綢，白 雪，楊云芳，羅 鋼

（瀘州醫(yī)學(xué)院附屬中醫(yī)院心腦病科，四川瀘州646000）

腦出血（intracerebral hemorrhage，ICH）是最常見的急性腦血管性疾病，發(fā)病率0.86%～7.32%，病死率50.0%～67.7%，存活患者約3／4不同程度地喪失勞動(dòng)能力，嚴(yán)重者喪失自理能力，給家庭及社會帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)等［1－2］。近年研究表明，ICH后血腫周圍組織存在大量蛋白酶激活受體－1（proteinase activated receptor－1，PAR－1）可引起細(xì)胞凋亡，但I(xiàn)CH后PAR－1、小膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)凋亡細(xì)胞關(guān)系未見研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)主要采用ICH大鼠模型，探討ICH后PAR－1、血腫周圍神經(jīng)細(xì)胞凋亡、小膠質(zhì)細(xì)胞之間關(guān)系及PAR－1在ICH后腦損傷可能存在的病理、生理機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠60只280～320g（由瀘州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），PAR－1抗體（Sigma公司），TUNEI試劑盒（Roche公司），OX－42（CD11b）單抗（Sigma公司）。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組及動(dòng)物模型建立 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為假手術(shù)組、ICH組，每組30只，每組再隨機(jī)分為6個(gè)亞組。本實(shí)驗(yàn)采用自體不凝血注入大鼠ICH模型，參照Xue等［3］方法制備腦出血模型。2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉（30mg／kg）后固定于大鼠腦立體定位儀上，正中切開頭皮，暴露前囟、冠狀縫，選擇前囟后0.5mm、右3.0mm、深度5.5mm為自體凝血注射部位；同時(shí)剪斷鼠尾，含抗凝劑EP管收集鼠尾滴下血，微量注射器抽不凝血50μL緩慢勻速5μL／min注入殼尾核，骨蠟填塞針孔，縫合頭皮。假手術(shù)組以0.9%生理鹽水50μL代替自體血。術(shù)后給予同等環(huán)境及飼料喂養(yǎng)。術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)：6h、1 d、2d、3d、5d、7d斷頭處死大鼠。

1.2.2 觀察指標(biāo)

1.2.2.1 PAR－1陽性細(xì)胞數(shù) 將各組各時(shí)間點(diǎn)大鼠斷頭取腦，4%甲醛溶液固定，石蠟包埋，取出腦組織在血腫區(qū)做冠狀切片，常規(guī)脫水、浸蠟、包埋，將腦組織切成厚4mm切片，采用免疫組織化學(xué)染色（SP）法觀察PAR－1陽性細(xì)胞數(shù)，將SP法染色切片在400倍光學(xué)顯微鏡下觀察，主要分布在血腫周圍組織，胞膜、胞質(zhì)呈棕黃色，可清楚的分辨出細(xì)胞核形態(tài)的為PAR－1陽性細(xì)胞。隨機(jī)選取5個(gè)視野，取其平均值。

1.2.2.2 凋亡神經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù) 腦組織石蠟載片用TUNEL原位染色（按說明書進(jìn)行），400倍光學(xué)顯微鏡下觀察，細(xì)胞核中有紫紅色顆粒者為TUNEL染色陽性凋亡神經(jīng)細(xì)胞。凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)方法同PAR－1SP法。

1.2.2.3 小膠質(zhì)細(xì)胞計(jì)數(shù) 使用OX－42標(biāo)記小膠質(zhì)細(xì)胞方法［4］。OX－42陽性細(xì)胞：主要是小膠質(zhì)細(xì)胞（核呈棕黃色）。ICH組在6h時(shí)OX－42染色較淺，數(shù)量少，細(xì)胞形態(tài)欠清楚，尚可見長的突起，24h時(shí)數(shù)量明顯增多，形態(tài)改變呈圓形、橢圓型或梭型，2d時(shí)數(shù)量和體積達(dá)高峰，以后逐漸減少，7d仍可觀察到其數(shù)量較少、形態(tài)變化不大。在假手術(shù)組未見有OX－42陽性細(xì)胞。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以s表示。ICH組內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)及與假手術(shù)組比較采用單因素方差分析，確定有差異后采用最小有意義差異法比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

ICH組不同時(shí)點(diǎn)血腫周圍PAR－1陽性細(xì)胞、凋亡細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞與假手術(shù)組比較明顯增加，PAR－1陽性細(xì)胞、凋亡細(xì)胞3d達(dá)高峰，之后PAR－1逐漸下降至正常，但凋亡細(xì)胞下降緩慢仍維持較高水平，小膠質(zhì)細(xì)胞2d達(dá)高峰，之后逐漸下降，與PAR－1陽性細(xì)胞、凋亡細(xì)胞比較三者呈正相關(guān)（P＜0.05），見表1～3。光鏡下血腫周圍組織，胞漿或胞核中染有棕黃色顆粒者為PAR－1陽性細(xì)胞；染色質(zhì)濃集于核周、呈新月形、環(huán)形、長條形、塊狀小體甚至形成核碎片狀為凋亡細(xì)胞；小膠質(zhì)細(xì)胞為OX－42標(biāo)記的陽性細(xì)胞，核呈棕黃色，有突起，見圖1～6。

表1 兩組PAR－1陽性細(xì)胞數(shù)±s）

表1 兩組PAR－1陽性細(xì)胞數(shù)±s）

＊：P＜0.05，與假手術(shù)組比較；△：P＜0.05，與ICH組3d比較。

組別6 31.30±4.53 31.30±4.53 ICH組 69.40±6.87＊△ 168.00±6.27＊△ 245.00±4.72＊△ 298.00±8.05＊ 97.70±5.57＊△ 30.60±5.57 6h 1d 2d 3d 5d 7d假手術(shù)組 16.00±5.13 16.00±3.28 31.50±5.93 31.80±3.7△

表2 兩組TUNEL染色陽性細(xì)胞數(shù)±s）

表2 兩組TUNEL染色陽性細(xì)胞數(shù)±s）

＊：P＜0.05，與假手術(shù)組比較；△：P＜0.05，與ICH組3d比較。

組別0±1.65 3.40±1.61 ICH組 65.00±2.69＊△ 91.80±8.29＊△ 106.00±5.31＊ 171.00±6.76＊ 112.30±7.67＊△ 98.20±8.33 6h 1d 2d 3d 5d 7d假手術(shù)組 3.60±1.24 3.40±2.01 3.50±2.59 3.50±1.96 3.3＊△

表3 兩組小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)比較

表3 兩組小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)比較

＊：P＜0.05，與假手術(shù)組比較；△：P＜0.05，與ICH組2d比較。

組別6h 1d 2d 3d 5d 7d假手術(shù)組000000 ICH組 28.30±3.68＊△ 62.80±5.78＊△ 96.80±9.57＊ 79.60±7.89＊△ 50.30±8.12＊△ 16.90±6.32＊△

圖1 假手術(shù)組PAR－1陽性細(xì)胞（×400）；

圖2 ICH組3dPAR－1陽性細(xì)胞（×400）；

圖3 假手術(shù)組TUNEL陽性細(xì)胞（×400）

圖4 ICH組3dTUNEL陽性細(xì)胞（×400）；

圖5 假手術(shù)組OX－42陽性細(xì)胞（×400）；

圖6 ICH組2dOX－42陽性細(xì)胞（×400）

3 討 論

ICH最主要的病理改變?yōu)檠[對周圍腦組織的壓迫和血腫的介質(zhì)釋放所誘發(fā)的繼發(fā)性損傷。血腫壓迫周圍腦組織可引起血腫周圍腦組織機(jī)械性損傷，同時(shí)占位效應(yīng)導(dǎo)致血腫周圍微循環(huán)障礙、血管痙攣、再灌注損傷等，進(jìn)一步引起腦組織缺血、缺氧，發(fā)生腦神經(jīng)細(xì)胞的缺血壞死［5］。另外，血腫壓迫周圍腦組織血液循環(huán)障礙，繼發(fā)性酸中毒、血管麻痹、血液分解產(chǎn)物釋放生物活性物質(zhì)等加重對腦組織的損害；血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷產(chǎn)生的內(nèi)皮素可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載激惹神經(jīng)毒性氨基酸，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的缺血壞死和凋亡。

ICH后血腫降解釋放出凝血酶、血紅蛋白、血漿蛋白和C反應(yīng)蛋白等活性物質(zhì)，在對ICH后腦組織繼發(fā)性損傷中凝血酶占據(jù)重要角色［6－7］。凝血酶由無活性的凝血酶原產(chǎn)生，是凝血級聯(lián)反應(yīng)過程的關(guān)鍵酶，也是重要的細(xì)胞外信號因子之一［8－9］。凝血酶的生物活性主要由 PAR－1介導(dǎo)，PAR－1在腦內(nèi)海馬、丘腦、下丘腦、紋狀體等部位廣泛分布。正常生理狀態(tài)下，體內(nèi)有PAR－1少量表達(dá)，激活后介導(dǎo)跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)：細(xì)胞內(nèi)Ca2＋的移動(dòng)和蛋白磷酸化，產(chǎn)生一系列生理效應(yīng)［10］；病理狀態(tài)下，組織損傷后，PAR－1表達(dá)明顯上調(diào)，可能介導(dǎo)凝血酶的系列反應(yīng)，引起神經(jīng)細(xì)胞毒性損傷，導(dǎo)致死亡［11－13］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ICH后血腫周圍PAR－1陽性細(xì)胞、凋亡細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞明顯增加，PAR－1陽性細(xì)胞、凋亡細(xì)胞3d達(dá)到高峰，小膠質(zhì)細(xì)胞2d達(dá)到高峰，高峰之后逐漸下降，說明ICH后PAR－1陽性細(xì)胞與神經(jīng)凋亡細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)基本一致，ICH后PAR－1表達(dá)上調(diào)可能通過以下途徑引起細(xì)胞凋亡：（1）血腫壓迫周圍腦組織導(dǎo)致機(jī)械性損傷致腦神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。局部腦組織受擠壓發(fā)生缺血改變，腦血管通透性的增加致腦水腫及腦內(nèi)高壓加重腦組織缺血、缺氧，進(jìn)而可能介導(dǎo)PAR－1釋放增加，凝血酶原大量激活導(dǎo)致一系列級聯(lián)反應(yīng)，神經(jīng)細(xì)胞凋亡明顯增加，和李恒等［14］實(shí)驗(yàn)研究PAR－1與凝血酶在ICH后的表達(dá)趨勢基本一致；（2）血腫本身的血細(xì)胞破壞、炎性介質(zhì)釋放，大量凝血酶原激活可能通過PAR－l介導(dǎo)而增加血腦屏障通透性，造成血管源性腦水腫，另外，凝血酶也可能通過PAR－1介導(dǎo)而影響水通道蛋白4的機(jī)能［15］，加劇ICH后腦組織水腫。（3）除作為ICH啟動(dòng)腦水腫形成的“扳機(jī)點(diǎn)”外，凝血酶可以通過PAR－1介導(dǎo)引起小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，然后可能通過2條途徑發(fā)揮細(xì)胞毒性效應(yīng)。一是通過釋放一系列潛在的神經(jīng)毒性物質(zhì)、炎性因子和酶等導(dǎo)致繼發(fā)性腦損害，介導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡；二是通過與神經(jīng)細(xì)胞直接接觸，發(fā)揮腦內(nèi)吞噬細(xì)胞的毒性作用［16－17］，進(jìn)而可能加重ICH后的繼發(fā)性損傷。

本研究表明，ICH后凝血酶可能通過不斷激活PAR－1，PAR－1再次激活神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞大量產(chǎn)生盡而進(jìn)一步損害腦神經(jīng)細(xì)胞和對細(xì)胞毒性損害作用，造成腦細(xì)胞毒性水腫、炎性介質(zhì)反應(yīng)等多種損傷機(jī)制導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡。ICH腦出血損傷的病理生理機(jī)制極其復(fù)雜，通過對PAR－1介導(dǎo)的腦神經(jīng)細(xì)胞的凋亡的深入研究可能對今后臨床治療ICH提供一定的科學(xué)依據(jù)。

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